核磁共振內(nèi)標(biāo)法測定蘇丹紅I對照品的含量

耿巖玲，馬然，劉偉，高紅梅，劉建華，王曉，段文娟*

(1.山東省科學(xué)院中藥過程控制研究中心，山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014;2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

蘇丹紅是一種人工合成的紅色染料，常作為工業(yè)染料廣泛應(yīng)用于石油、機(jī)油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是增色，也可用于鞋、地板等的增光。蘇丹紅有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號4種，該類物質(zhì)具有偶氮結(jié)構(gòu)，毒理學(xué)研究表明其具有致突變性和致癌性，在我國和世界上許多國家都禁止用于食品中。但由于具有良好的光澤持久性與穩(wěn)定性，不法商販將其用于改善食品的感官色澤。近年來，蘇丹紅色素，特別是蘇丹紅I，經(jīng)常被添加到辣椒及相關(guān)食品、熟食和口紅中，對人類健康的危害非常大［1－2］。目前蘇丹紅I的含量測定方法主要有液相色譜法、薄層色譜法、色質(zhì)聯(lián)用法等［3－5］，雖然采用色譜法進(jìn)行含量測定在分離上具有一定的優(yōu)勢，但是由于殘留的溶劑、無機(jī)物等雜質(zhì)與被測物質(zhì)色譜響應(yīng)值不同，造成了樣品的絕對含量測定結(jié)果不準(zhǔn)確。而且，采用以上方法測定含量均需要對照品。

早在20世紀(jì)70年代，就有關(guān)于核磁共振定量分析的報(bào)道。隨著超導(dǎo)高磁場的脈沖Fourier變換核磁共振譜儀的應(yīng)用，核磁共振定量分析方法在準(zhǔn)確度、靈敏度及分析速度等方面都得到了極大的提高，已經(jīng)接近HPLC的水平，而且這種分析法具有所需樣品量少、掃描時(shí)間短以及無需標(biāo)準(zhǔn)品等優(yōu)點(diǎn)［6］。核磁共振定量分析法用于樣品的含量測定已有文獻(xiàn)報(bào)道，美、英等國和地區(qū)的藥典中也先后引入了此方法［7－10］，但是有關(guān)采用此方法進(jìn)行蘇丹紅含量測定的研究未見報(bào)道。本研究采用核磁共振內(nèi)標(biāo)法對蘇丹紅I對照品的含量進(jìn)行測定，以期建立在沒有對照品的情況下蘇丹紅I的含量測定和質(zhì)量控制方法，并為其他化學(xué)對照品含量的測定方法提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

Varin Inova 600mHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(美國 Varian公司)。

1.2 試劑

氘代氯仿 (美國CIL公司，氘代度＞99.9%)，苯甲酸(美國Sigma公司，批號101253928，純度99.2%)，蘇丹紅I對照品(山東省分析測試中心研制)。蘇丹紅I和苯甲酸的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 蘇丹紅I和苯甲酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of Sudan I and benzoic acid

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

測定溫度:25 ℃，F(xiàn)T size:131072，譜寬:15000.9 Hz，環(huán)境濕度:35%，觀察頻率:599.773 MHz，采集時(shí)間:3.000 s，累加次數(shù):32。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［11］，分別精密稱取適量蘇丹紅I對照品和苯甲酸對照品，置于直徑5 mm的核磁共振樣品管中，加適量氘代氯仿試劑振蕩溶解，制成待測試樣溶液。在上述實(shí)驗(yàn)條件下調(diào)整儀器參數(shù)，勻場、采樣，得到圖譜后再進(jìn)行相位和基線調(diào)整，對蘇丹紅I和苯甲酸的定量峰分別進(jìn)行積分，按照1H-NMR內(nèi)標(biāo)法根據(jù)積分結(jié)果用以下公式計(jì)算樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

上述公式中，As:被測樣品定量峰的積分面積，ns:被測樣品定量峰包含的質(zhì)子數(shù)，Ms:被測樣品的分子質(zhì)量，Ar:內(nèi)標(biāo)物質(zhì)定量峰的積分面積，nr:內(nèi)標(biāo)物質(zhì)定量峰包含的質(zhì)子數(shù)，Mr:內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的分子質(zhì)量，mr:稱取的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量，Wr:內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ms:樣品的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑、內(nèi)標(biāo)和定量特征峰的選擇

測試溶劑應(yīng)選擇對被測樣品和內(nèi)標(biāo)物溶解性都非常好且不造成干擾的氘代試劑。本研究選擇氘代氯仿為測試溶劑，該溶劑對蘇丹紅I和苯甲酸的溶解性都很好，且核磁共振氫譜上的溶劑峰在δ 7.26，對其他信號峰無干擾，不會影響含量測定結(jié)果。選擇苯甲酸為內(nèi)標(biāo)物，從苯甲酸的核磁共振氫譜中可以看到苯甲酸的2位和6質(zhì)子信號在δ 8.13，與其他信號完全分開，因此，可作為內(nèi)標(biāo)物。

在定量分析之前，已經(jīng)通過核磁共振一維譜和二維譜對目標(biāo)化合物的信號進(jìn)行了全歸屬。在蘇丹紅I的核磁共振氫譜上可以看到，5位的質(zhì)子信號化學(xué)位移在δ 8.51，與其他信號完全分開，因此，可作為定量分析的特征峰。核磁共振氫譜法測定蘇丹紅I含量的圖譜見圖2。

圖2 核磁共振氫譜法測定蘇丹紅I含量的圖譜Fig.2 1H-NMR spectrum of sudan I content determination

2.2 線性關(guān)系

按1.4的實(shí)驗(yàn)方法制備6個(gè)不同濃度的樣品溶液，測定1H-NMR譜，分別對蘇丹紅I和苯甲酸特征信號峰的峰面積進(jìn)行積分，每個(gè)樣品的積分面積取3次積分的平均值，結(jié)果見表1。

表1 蘇丹紅I與苯甲酸的質(zhì)量及峰面積積分值Table 1 Mass and integral value of peak area of Sudan I and benzoic acid

以蘇丹紅I和苯甲酸的積分面積比值y對蘇丹紅I和苯甲酸質(zhì)量比值x做線性關(guān)系圖，得回歸方程為y=0.2424x－0.0028，相關(guān)系數(shù)r=0.9982。結(jié)果表明，采用核磁共振內(nèi)標(biāo)法對蘇丹紅I的含量進(jìn)行測定，線性關(guān)系良好。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取2.2的2號樣品，在上述同一實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)測定6次，以蘇丹紅I和苯甲酸定量特征峰的積分面積比值計(jì)算，檢測重復(fù)性，RSD值為0.53%，結(jié)果表明，此方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取2.2的 2號樣品，室溫下放置，按1.4的實(shí)驗(yàn)方法，分別于 0、4、6、8、10 h后測定，檢測穩(wěn)定性，RSD 值為0.656%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別取6份已知含量的蘇丹紅I樣品約5 mg，精密稱定，分別加入高、中、低3個(gè)濃度的蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品，按1.4的實(shí)驗(yàn)方法測定1H-NMR譜，按回收率(%)=［測得含量－樣品含量］/標(biāo)準(zhǔn)品添加，計(jì)算回收率，所得結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 2 Experiment of the average recovery rate(n=6)

2.6 樣品測定

按照上述實(shí)驗(yàn)條件和方法，測定3批蘇丹紅I對照品和苯甲酸特征峰的峰面積，根據(jù)1.4的計(jì)算公式計(jì)算出蘇丹紅I對照品的絕對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)采用高效液相色譜(HPLC)法對此3批蘇丹紅I對照品的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。由表3中可以看到，采用核磁共振波譜法測得蘇丹紅I對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略低于HPLC峰面積歸一化法。

表3 3批蘇丹紅I對照品含量測定結(jié)果(質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%)Table 3 Determination result of the content of 3 batches of Sudan I

2.7 掃描次數(shù)的選擇

將掃描次數(shù)設(shè)定為4、8、16、32、64、128，對樣品分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，掃描次數(shù)越多，信號信噪比越好，但是掃描次數(shù)的改變對樣品和內(nèi)標(biāo)物積分面積的比值沒有明顯的影響，因此選擇掃描次數(shù)為32。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用核磁共振波譜法對蘇丹紅I含量進(jìn)行測定，線性關(guān)系、重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好。此方法具有樣品量小、高效、簡便、無需對照品等優(yōu)點(diǎn)，含量測定和結(jié)構(gòu)鑒定可同步完成，可以用于其他化學(xué)對照品含量的測定。

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