谷物中伏馬菌素B1殘留的直接競爭ELISA檢測方法研究

介明沙，張衛(wèi)民，于 斐，玉崧成，吳擁軍*，張洪權(quán)

（1.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；3.河南天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463002）

0 引言

伏馬菌素（Fumonisins）是一類主要由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素[1]，主要存在于玉米、小麥等谷物及其制品中.FB1是伏馬菌素的主要組分，是導(dǎo)致Fumonisins 產(chǎn)生毒性的主要因素，其促癌性和致癌性已得到證實[2].國際癌癥研究中心（IARC）把FB1劃分到2B 組，即人類可能的致癌物[3].目前常用的檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）[4]，高效液相色譜法（HPLC）[5-6]和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[7-8]等；TLC 法應(yīng)用較早，但其操作繁瑣、靈敏度和特異性也較差；儀器檢測靈敏、準確，研究與應(yīng)用較多的是HPLC 法，但其成本高、需要昂貴的設(shè)備、樣品前處理過程復(fù)雜、需要專業(yè)人員操作，推廣使用受到一定限制；ELISA 法快速、靈敏、特異強，檢測生物毒素殘留安全、可靠，其規(guī)?；Y選特點使其更能滿足常規(guī)化檢測的需要[9].但是，目前常用的間接競爭ELISA 試驗存在檢測時間長、步驟繁瑣等缺陷.本研究針對這一問題，通過HRP-FB1的制備和應(yīng)用，建立直接競爭ELISA 檢測方法，目的在于簡化檢測步驟、縮短檢測時間、提高谷物中FB1殘留的檢測水平.

1 材料與方法

1.1 儀器

WELLSCAN MK3 酶標儀：Thermo；高效液相色譜儀：安捷倫；C18固相微萃取柱：Agela Technologies；UV-1606 紫外分光光度儀、Irprestige-21 型傅立葉紅外分光光度儀：日本島津；FW-100 型高速萬能粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；XK96-A型快速混勻器：姜堰市新康醫(yī)療機械有限公司.

1.2 材料

用于加標試驗的玉米樣品購自洛陽市某超市（經(jīng)HPLC 檢測不含F(xiàn)B1殘留）.

用于HPLC 檢測的玉米樣品取自河南駐馬店、新鄉(xiāng)等地區(qū)糧油公司.

辣根過氧化物酶HRP（RZ＞3.0，活性＞250 U/mg）：ROCHE Inc，SANLAND；FB1單抗（Abcam）、FB1標準品、卵清蛋白（OVA）：Sigma 公司；酶標抗原HRPFB1為自制；ELISA 顯色液A、B：河南華美生物公司；其他試劑均為分析純.

1.3 酶標抗原HRP-FB1 的制備

取2 mL 0.1 mg/mL 的HRP 溶液逐滴加入到3 mL 1.6×10-3mg/mL 的FB1溶液中，混勻后逐滴加入2.5%的戊二醛溶液1.6 mL，避光攪拌4 h 后向此溶液中加入0.8 mL 1 mol/L 的乙醇胺，室溫溫育15～20 min，將所得溶液裝入透析袋中，用PBS 緩沖溶液（0.01 mol/L，pH7.2）透析3 d.

1.4 樣品的前處理

首先將玉米樣品用高速粉碎機粉碎，過300 目分子篩，然后進行四分法縮分，取5 g 樣品，放入100 mL 的具塞試管中，加入75%的甲醇溶液10 mL，振蕩提取30 min，5 000 r/min 條件下離心15 min，濾紙過濾，保留濾液，用PBS 進行5 倍稀釋，4 ℃保存，供ELISA 檢測所用.

1.5 試驗方法

（1）包被：用Tris-HCl 緩沖溶液（pH 9.6，0.1 mol/L）將FB1單抗1∶8 000 稀釋后包被到96 孔酶標板上，每孔200 μL，37 ℃溫育2 h；（2）洗滌：每孔用洗滌液PBST 洗滌2 次，棄去洗滌液，在吸水紙上拍干；（3）封閉：用1%的OVA-PBS 緩沖液封閉，每孔300 μL，37 ℃溫育2 h，洗滌3 次后拍干；（4）競爭性免疫反應(yīng)：每孔加入100 μL 的FB1標準品溶液或谷物樣品提取液和100 μL 的HRP-FB1溶液，37 ℃溫育1 h，重復(fù)洗滌過程；（5）顯色反應(yīng)：各孔依次加入顯色液A、B 各50 μL，37 ℃避光反應(yīng)20 min；（6）終止反應(yīng)：每孔加入50 μL 2 mol/L的H2SO4終止液；（7）吸光度測定：酶標儀在490 nm波長處測定各孔吸光度A（參比吸光度為630 nm）.

1.6 標準曲線的繪制

配制質(zhì)量濃度分別為200、300、400、500、600、800 ng/mL 的FB1標準溶液，以FB1質(zhì)量濃度為橫坐標，F(xiàn)B1標準樣品各濃度孔的吸光度與FB1零標準品孔吸光度的比值（OD/OD0）為縱坐標，繪制標準曲線.

1.7 精密度及加標回收率

在處理好的空白玉米樣品溶液（HPLC 鑒定）中，分別加入FB1標準品，配制質(zhì)量濃度為200、400、600 ng/mL 的3 個加標樣品溶液，采用本方法進行檢測，每個濃度測定6 次，考察ELISA 法檢測加標玉米樣品的精密度和準確度，并與HPLC 法進行比較.

1.8 HPLC 確證試驗

取C18固相微萃取柱凈化后的陽性樣品溶液適量，應(yīng)用HPLC 進行確證試驗[10].

1.9 特異性考察

選取真菌毒素嘔吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黃曲霉毒素B1（AFB1），按照ELISA 操作步驟得出相應(yīng)的抑制率，計算交叉反應(yīng)率.

2 結(jié)果與討論

2.1 HRP-FB1 的制備及表征

參照文獻[11]，選用戊二醛法制備HRP-FB1偶聯(lián)物，分別采用紫外光譜法和紅外光譜法對其進行表征.利用紫外可見光譜比較FB1、HRP、FB1-HRP 的特征吸收峰：FB1在200 nm 附近有最大吸收峰，HRP 在405、265、205 nm 有特征吸收峰；而FB1-HRP 的特征吸收峰為405、265、205 nm，初步推斷偶聯(lián)成功.同時根據(jù)紅外光譜掃描情況可知，F(xiàn)B1-HRP 在3 410～3 460 cm-1范圍內(nèi)具有較強較寬的吸收峰，包括FB1分子N—H 鍵伸展振動產(chǎn)生的3 410 cm-1吸收峰和HRP 分子內(nèi)O—H 鍵伸展振動產(chǎn)生3 462 cm-1吸收峰，并且在1 612 cm-1出現(xiàn)FB1的特征吸收峰，確認偶聯(lián)成功.

2.2 ELISA 法標準曲線、精密度及加標回收率

按照ELISA 方法測定一系列濃度的標準溶液，根據(jù)測定結(jié)果繪制標準曲線，結(jié)果見圖1.得出標準曲線方程為Y=-0.000 8X+0.978 9，X 為FB1的質(zhì)量濃度，Y 為FB1標準樣品各濃度孔的吸光度與FB1零標準品孔吸光度的比值（OD/OD0），線性范圍在200～800 ng/mL 之間，根據(jù)OD/OD0=1.2 求得檢測限[12]為182.4 ng/mL.以200、400、600 ng/mL3 個加標樣品平行測定6 次，分別做批間變異和批內(nèi)變異試驗，得到批內(nèi)變異系數(shù)為6.4%～8.3%，平均批內(nèi)變異系數(shù)為7.4%；批間變異系數(shù)為6.2%～9.5%，平均批間變異系數(shù)為7.7%，均小于10%；應(yīng)用ELISA 法平行測定6 次，檢測加標樣品中FB1的回收率在85%～105%之間，平均回收率為98.5%.

圖1 ELISA 法測定FB1 的標準曲線

2.3 ELISA 法與HPLC 法的方法學(xué)比較

比較ELISA 法與HPLC 法的線性范圍、精密度及回收率，結(jié)果見表1.由表1 可見，ELISA 法回收率較高，其靈敏度、精密度能滿足實際需求.

表1 ELISA 與HPLC 的方法學(xué)比較（n=6）

2.4 HPLC 確證試驗

同時采用ELISA 與HPLC 法檢測陽性樣品，相關(guān)性采用直線相關(guān)和回歸分析，以HPLC 法測得的結(jié)果為橫坐標，以ELISA 法測得的結(jié)果為縱坐標作線性回歸分析.結(jié)果顯示，二者相關(guān)性良好（r=0.999 6），ELISA 法回收率較高.

2.5 特異性考察結(jié)果

選取真菌毒素嘔吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黃曲霉毒素B1（AFB1），用PBS 配制一系列質(zhì)量濃度的溶液，按照ELISA 標準曲線的操作步驟得到相應(yīng)的抑制率，計算交叉反應(yīng)率（Cross-reactivity，CR），過程如下：以不同濃度的抗原和結(jié)構(gòu)類似抗原物質(zhì)分別求各自IC50，按下列公式計算交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表2.

式中:CR 為交叉反應(yīng)率；y 為FB1抗原的IC50；Z 為結(jié)構(gòu)類似抗原的IC50.

表2 ELISA 方法檢測FB1 的特異性

由表2 可知，伏馬菌素FB1單抗對其他真菌毒素?zé)o特異性反應(yīng)，說明建立的ELISA 方法測定FB1特異性良好.

3 結(jié)論

從ELISA 與HPLC 方法學(xué)比較數(shù)據(jù)來看，國標方法在靈敏度、精密度、線性范圍上都優(yōu)于ELISA，但是ELISA 方法前處理簡單、省時，而HPLC 前處理極其復(fù)雜，處理過程中待測毒素有一定程度損失，造成回收率偏低.從確證試驗看，二者相關(guān)性良好.ELISA 方法具有實際推廣意義.

綜上所述，本研究采用自制的HRP-FB1建立的dc-ELISA 方法雖在靈敏度和精密度方面較國標方法稍差，但其前處理簡單、檢測時間短，可實現(xiàn)大批量樣品的檢測；相比間接競爭ELISA（idc-ELISA），其檢測速度較快，可以應(yīng)用于檢測玉米等谷物中的FB1含量，其準確、高效、成本低，適于在非實驗室或半實驗室條件下對大批量樣品進行初篩檢測.

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