NFKB1基因啟動子區(qū)-94ins/del ATTG多態(tài)性在新疆漢族和維吾爾族及哈薩克族人群中的分布特征及其與血脂的關系

董星輝，李曉梅，楊毅寧，馬依彤，謝 翔，張金宇

核因子Kappa B(NF-κB)是一組具有重要轉錄調節(jié)作用的蛋白質，能與許多細胞因子、黏附因子等基因啟動子或增強子部位κB位點發(fā)生特異性結合，啟動和調節(jié)基因轉錄，在多種急慢性炎癥性疾病、腫瘤和變態(tài)反應性疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。人類NF-κB主要由p50及p65異源二聚體組成，分別由NFKB1及RelA基因編碼。近年來，NFKB1基因的遺傳多態(tài)性及其與疾病的易患性關系受到廣泛關注，NFKB1基因啟動子區(qū)-94ins/del ATTG基因多態(tài)性與多種心血管疾病及腫瘤性疾病相關。del等位基因可能增加高加索人群患冠心病的風險[3]，并加快心力衰竭早期患者心功能惡化的進程[4]，攜帶不同基因型的糖尿病患者攝入多不飽和脂肪酸后血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平升高的程度不同[5]。而有關該基因多態(tài)性與腫瘤疾病易患性的研究表明，該基因多態(tài)性在地區(qū)及民族分布中有較大差異性，不同地區(qū)及不同民族該位點多態(tài)性對疾病的易患性不同[6-8]。新疆是一個多民族地區(qū)，不同民族在冠心病、高血壓、高脂血癥等患病率上存在較大差異[9-10]，而關于NFKB1基因啟動子區(qū)-94ins/del ATTG多態(tài)性在中國新疆漢族、維吾爾族及哈薩克族人群中分布頻率尚無報道。本研究旨在探討新疆地區(qū)漢族、維吾爾族及哈薩克族人群NFKB1基因啟動子區(qū)-94ins/del ATTG多態(tài)性分布特征的差異，并比較各異常血脂與正常血脂基因型分布差異，為今后研究基因NFKB1啟動子區(qū)-94ins/del ATTG多態(tài)性與心血管疾病的相關性提供幫助。

1 對象與方法

1.1 納入與排除標準 納入標準：(1)年齡35～65歲；(2)受試者間無直接血緣關系；(3)經詳細的病史調查、體格檢查、心電圖、心臟超聲、血糖及腎功能等檢測未見異常。排除標準：(1)正在服用降血脂藥物者；(2)既往有冠心病、糖尿病、腎病綜合征、急性肝炎、甲狀腺功能異常等影響血脂代謝的疾病病史者；(3)實時熒光定量PCR儀無法自動分型者。

1.2 研究對象 采用整群隨機抽樣方法，于2008—2010年選擇新疆烏魯木齊、福海、吐魯番、伊犁、克拉瑪依、和田、阜康7個地區(qū)共26個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，選取漢族604名、維吾爾族585名及哈薩克族566名，受試者均已簽署知情同意書。

1.3 試劑與儀器 血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；實時熒光定量PCR儀7900HT、SNP、Master mix、光學96孔板、封板膜購自美國應用生物系統(tǒng)公司；低速離心機購自安徽中科中佳科學儀器有限公司，型號SC-3610。

1.4 基本資料收集及血生化指標的測定 受試者身高、體質量安排專人測量，計算體質指數(shù)(BMI)，并記錄吸煙、飲酒情況；血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、HDL-C、血清葡萄糖(Glu)均由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗中心統(tǒng)一測定。

1.5 基因組DNA提取 受試者均禁食約12 h后，采集外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取標本基因組DNA。測定DNA濃度，加入雙蒸水進行稀釋，調整DNA濃度為50 μg/L，純度要求為A260/A280為1.7～1.9。

1.6 實時熒光定量PCR法 在避光的環(huán)境下以SNP 0.15 μl，Master mix 3 μl，DNA 1 μl，雙蒸水1.85 μl為一個反應體系配置成110個反應體系的母液，使用10 μl加樣槍以6 μl為一個反應體系依次加入96孔板中，使用封板膜封板后在低速平板離心機以2 879×g離心1 min，啟動實時熒光定量PCR儀操作軟件，將離心后的96孔板放置于儀器中，調節(jié)擴增反應條件：50 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 min，40個循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)，擴增結束后操作Analysis軟件進行自動分型。1.7 診斷標準 根據(jù)2007年中國成人血脂異常防治指南，分別將TC、TG、LDL-C邊緣性升高者、升高者及HDL-C降低者歸為異常血脂者，具體標準如下：TC≥5.18 mmol/L為高TC血癥；TG≥1.70 mmol/L為高TG血癥；LDL-C≥3.37 mmol/L為高LDL-C血癥；HDL-C<1.04 mmol/L為低HDL-C血癥。

2 結果

2.1 基礎資料比較 三民族性別、年齡、Glu比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；三民族BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、吸煙率及飲酒率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。三民族在TC、TG、HDL-C、LDL-C上的差異符合新疆流行病學調查結果[10]。

2.2 NFKB1基因啟動子區(qū)-94ins/del ATTG基因型與等位基因頻率比較 漢族、維吾爾族、哈薩克族NFKB1基因啟動子區(qū)-94ins/del ATTG基因型分布經Hardy-Weinberg平衡檢驗，均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.035，P=0.309；χ2=1.072，P=0.300；χ2=3.630，P=0.057)，研究人群適合進行群體遺傳學研究。三民族基因型分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。哈薩克族del/del基因型頻率均低于漢族和維吾爾族，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.986,P<0.01)。三民族del等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 血脂異常組與血脂正常組基因型頻率比較 比較漢族、維吾爾族和哈薩克族血脂異常組中del等位基因攜帶者(ins/del型+del/del型，ID+DD型)與血脂正常組中ID+DD型者分布頻率，結果顯示，三民族高TG血癥組和TG正常組、高TC血癥組和TC正常組、低HDL-C血癥組和HDL-C正常組ID+DD型頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；漢族高LDL-C血癥組ID+DD型頻率高于LDL-C正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3～6，因本研究開展范圍較大，血清樣本丟失或失效，以實際表格數(shù)據(jù)為準)。

2.4 多因素Logistic回歸分析 將漢族人群是否患有高LDL-C血癥作為因變量，將性別、年齡、BMI、TG、HDL-C、吸煙、攜帶del等位基因作為自變量，結果顯示，攜帶del等位基因、年齡、TG、HDL-C為影響漢族人群患有高LDL-C血癥的因素(P<0.05，見表7)。

表1 三民族基礎資料比較Table 1 Comparison of general data among the three peoples

表2 三民族不同基因型及等位基因頻率比較〔n(%)〕Table 2 Comparison of genotype and allele frequencies among the three peoples

表3 不同民族高TG血癥組和TG正常組ID+DD型頻率比較Table 3 Comparison of frequency of ID+DD genotype between different peoples with high TG and normal TG

表4 不同民族高TC血癥組和TC正常組ID+DD型頻率比較 Table 4 Comparison of frequency of ID+DD genotype between different peoples with high TC and normal TC

表5 不同民族高LDL-C血癥組和LDL-C正常組ID+DD型頻率比較Table 5 Comparison of frequency of ID+DD genotype between different peoples with high LDL-C and normal LDL-C

表6 不同民族低HDL-C血癥組和HDL-C正常組ID+DD型頻率比較Table 6 Comparison of frequency of ID+DD genotype between different peoples with low HDL-C and normal HDL-C

表7 影響漢族人群患有高LDL-C血癥的多因素Logistic回歸分析Table 7 Multivariate Logistic regression analysis on factors influencing high level LDL-C in Han peoples

3 討論

NFKB1基因位于人類4號染色體2區(qū)4帶，長156 kb，包括啟動子序列、24個外顯子和其間的內含子，編碼NFKB/Rel和IκB家族中的2種蛋白：一種是不與DNA結合的p105(p50前體)，另一種是與DNA結合的p50[11]。Karban等[12]對NFKB1基因啟動子區(qū)、編碼外顯子及內含子區(qū)域進行測序，結果顯示，在6個檢測出核苷酸變異位點中，只有啟動子區(qū)-94ins/del ATTG具有潛在功能，del等位基因可以降低NFKB1基因的轉錄活性，減少p50的產生，p50自身可以形成同源二聚體，其不能被IκB有效結合并缺乏轉錄活性區(qū)域，進入細胞核后與p65/p50異源二聚體競爭核蛋白κB序列，從而抑制p65/p50活性。del等位基因的存在使p50蛋白生成減少，p50/p50同源二聚體相應減少，從而增強p65/p50活性。NF-κB活性增強，可促進其下游參與炎性反應的相關基因，如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、細胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子1(VCAM-1)等表達增加[13]。

本研究報道NFKB1基因啟動子區(qū)域-94ins/del ATTG的基因型及等位基因在新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族間的分布頻率，結果顯示，哈薩克族del/del基因型及del等位基因頻率均低于漢族和維吾爾族，本試驗人群來自新疆維吾爾族自治7個地區(qū)的26個鄉(xiāng)鎮(zhèn)所，通過隨機抽樣方法選取，具有一定的人群代表性。del等位基因可以使p50/p50二聚體產生減少，從而增強p50/p65活性，增加下游的炎性因子，使冠心病發(fā)病增加。新疆疾病流行病學調查表明，新疆哈薩克族高血壓[14]、肥胖[15]、吸煙率等冠心病危險因素為漢族、維吾爾族、哈薩克族中最高的，但冠心病發(fā)病率卻為三民族中最低[9]，這種情況單純由飲食、環(huán)境因素不足以解釋，可能需從不同民族的不同遺傳背景入手，考慮哈薩克族與其他兩個民族相比，在del等位基因分布上的差別，可能是其冠心病發(fā)病率較低的保護因素，有待行進一步研究證實。

由NF-κB調節(jié)的許多細胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1等均對血脂代謝有影響[16]，但目前有關二者相關性的研究較少，Real等[17]對高膽固醇家族中冠心病與NF-κB的相關性研究顯示，家族性高膽固醇血癥患者中血漿LDL-C水平顯著升高，同時NF-κB活性和載脂蛋白B水平升高，提示患者體內的血脂代謝可能與NF-κB的活性相關。本研究對各異常血脂組中的基因型分布進行了分析比較，結果顯示，漢族高LDL-C血癥組del等位基因頻率高于LDL-C正常組，Logistic回歸分析結果顯示，攜帶del等位基因是影響漢族人群患有高LDL-C血癥的因素。但維吾爾族及哈薩克族del等位基因與高LDL-C血癥的關系，考慮與以下幾方面有關：(1)新疆維吾爾族及哈薩克族與漢族飲食及生活方式存在很大差異，維吾爾族和哈薩克族主要是以牛羊肉、奶制品和面食為主，蔬菜水果的攝入量較少，呈現(xiàn)高脂肪、高蛋白、高鹽的膳食特點，故相較于漢族人群而言，飲食環(huán)境的影響可能削弱遺傳因素對血脂水平的影響[18]。(2)NFKB1基因啟動序列-94位點在不同民族間對同一種疾病的易患性不同，這也許是del等位基因只與新疆漢族人群患高LDL-C血癥相關，而與新疆維吾爾族及哈薩克族間無關的原因。為進一步明確兩者間是否相關，可進一步加大樣本量，并同時測定不同患者及不同基因型間的NF-κB水平。

人類基因多態(tài)性的研究可以了解各種基因的基因型及等位基因在不同種族人群中的分布情況，有助于從基因水平更深刻地認識各種疾病在不同民族及人群中的發(fā)病率和臨床表現(xiàn)各異的內在機制。本研究報道NFKB1基因啟動子區(qū)-94ins/del ATTG的基因型及等位基因在新疆漢族、維吾爾族、哈薩克族間的分布頻率，發(fā)現(xiàn)哈薩克族del/del基因型及del等位基因頻率均低于漢族和維吾爾族；并且發(fā)現(xiàn)NFKB1基因啟動子區(qū)-94ins/del ATTG多態(tài)性與漢族人群發(fā)生高LDL-C血癥相關，為NFKB1基因啟動子區(qū)-94ins/del ATTG的群體遺傳學的研究和疾病相關性研究奠定基礎。但本研究對NFKB1基因啟動子區(qū)-94ins/del ATTG多態(tài)性與血脂關系的研究屬于橫斷面研究，對兩者之間的關系可以起到一定的提示作用，但兩者間具體聯(lián)系需進一步行病例對照試驗進行分析。

1 Chaturvedi MM，Sung B，Yadav VR，et al.NF-κB addiction and its role in canner：′one size does not fit all′[J].Oncogene，2011，30(14)：1615-1630.

2 Van der Heiden K，Cuhlmann S，Luong le A，et al.Role of nuclear factor kappa B in cardiovascular health and disease[J].Clin Sci(Lond)，2010，118(10)： 593-605.

3 Vogel U，Jensen MK，Due KM，et al.The NFKB1 ATTG ins/del polymorphism and risk of coronary heart disease in three independent populations[J].Atherosclerosis，2011，219(1)：200-204.

4 Santos DG，Resende MF，Mill JG，et al.Nuclear Factor(NF) kappa B polymorphism is associated with heart function in patients with heart failure[J].BMC Med Genet，2010，11：89.

5 Fontaine-Bisson B，Wolever TM，Connelly PW，et al.NF-kappaB-94Ins/del ATTG polymorphism modifies the association between dietary polyunsaturated fatty acids and HDL-cholesterol in two distinct populations[J].Atherosclerosis，2009，204(2)：465-470.

6 Lewander A，Butchi AK，Gao J，et al.Polymorphism in the promoter region of the NFKB1 gene increases the risk of sporadic colorectal cancer in Swedish but not in Chinese populations[J].Scand J Castroenterol，2007，42(11)：1332-1338.

7 Tang T，Cui S，Deng X，et al.Insertion/deletion polymorphism in the promoter region of NFKB1 gene increases susceptibility for superficial bladder cancer in Chinese[J].DNA Cell Biol，2010，29(1)：9-12.

8 Riemann K，Becker L，Stuwe H，et al.Insertion/deletion polymorphism in the promoter of NFKB1 as a potential molecular marker for the risk of recurrence in superficial bladder cancer[J].Int J Clin Pharmacol Ther，2007，45(8)：423-430.

9 馬依彤，楊毅寧，李曉梅，等.新疆漢、維、哈族人群心血管疾病流行病學調查[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

10 李艷，馬依彤，于子翔，等.新疆地區(qū)漢族、維吾爾族和哈薩克族人群血脂水平分布流行病學調查[J].中華流行病學雜志，2012，33(6)：567-571.

11 Sen R，Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences [J].Cell，1986，46(5)：705-716.

12 Karban AS，Okazaki T，Panhuysen CI，et al.Functional annotation of a novel NFKB1 promoter polymorphism that increases risk for ulcerative colitis[J].Hum Mol Genet，2004，13(1)：35-45.

13 Wolfrum S，Teupser D，Tan M，et al.The protective effect of A20 on atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice is associated with reduced expression of NF-kappaB target genes[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(47)：18601-18606.

14 劉芬，馬依彤，楊毅寧，等.新疆不同民族高血壓現(xiàn)況的流行病學調查[J].中華醫(yī)學雜志，2010，90(46)：3259-3263.

15 劉成，馬翔，馬依彤，等.新疆地區(qū)漢族、維吾爾族與哈薩克族超重和肥胖的患病率調查[J].中華流行病學雜志，2010，31(10)：1139-1143.

16 張欣，宋光耀，張明明，等.血脂異常類型與腫瘤壞死因子α、白細胞介素6和高敏C反應蛋白的相關性研究[J].臨床薈萃，2010，4(25)：322-324.

17 Real JT，Martínez-Hervás S，García-García AB，et al.Circulating mononuclear cells nuclear factor-kappa B activity，plasma xanthine oxidase，and low grade inflammatory markers in adult patients with familial hypercholesterolaemia[J].Eur J Clin Invest，2010，40(2)：89-94.

18 周玲，李南方，殷曉娟，等.新疆牧區(qū)少數(shù)民族血脂水平調查[J].中國臨床康復，2003，7(9)：1406-1407.