RP-HPLC 法測定澤蘭中樺木酸的含量

李 超，錢士輝*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210046;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京210028)

澤蘭(Lycopi Herba)是唇形科植物毛葉地瓜兒苗(Lycodus lucidus Turcz. var. hirtus Regel)的干燥地上部分，具有活血調(diào)經(jīng)、祛淤消癰、利水消腫的功效［1］，為臨床常用的活血化瘀類中藥，廣泛分布于東北、華北、華東、中南、西南及陜西甘肅等地。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)澤蘭中含有三萜酸類、酚酸類、黃酮類、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分［2-3］?！吨腥A人民共和國藥典》(2010)一部中只規(guī)定了澤蘭中烏索酸的定性鑒別，尚無定量控制方法［4］。本課題組對澤蘭進(jìn)行了較為系統(tǒng)的化學(xué)成分研究［5］，本文首次報(bào)導(dǎo)采用HPLC 法測定來自江蘇、安徽共10 個(gè)批次澤蘭中的樺木酸的含量，為澤蘭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695 高效液相色譜儀(四元泵自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng));Waters2996 二極管陣列紫外檢測器;Empower 化學(xué)工作站(美國沃特世公司);METTLER TOLEDO AT-201 十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);BUCHIR -200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司);KQ-500B 型超聲波清洗器(功率:250 W，頻率:50 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

樺木酸對照品為自制，歸一化法測得其純度大于98%。

1.3 藥材與試劑

不同批次澤蘭藥材購于南京各大藥房，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院錢士輝研究員鑒定為澤蘭。甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)為色譜純;磷酸為分析純;水為重蒸餾水(Milli-Q 純水器制得)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:AlltimaTM -C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液(85∶15);流速1. 0 mL·min-1);檢測波長為202 nm;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取已干燥至恒重的樺木酸對照品9.92 mg，放置于5 mL 容量瓶中，以甲醇溶解稀釋并定容至刻度，配置成樺木酸質(zhì)量濃度為1.984 mg/mL 的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取澤蘭粉末(過4 號(hào)篩，孔徑4.75 mm)約3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加95%乙醇100 mL，加熱回流4 h，過濾，旋干，用甲醇轉(zhuǎn)移并定容至10 mL 容量瓶中。以0.45 μm 微孔濾膜過濾，即制得供試品溶液。

2.4 對照品和樣品的色譜行為

按上述色譜條件，進(jìn)行樣品及對照品HPLC 檢測，樣品與對照品在相同的保留時(shí)間處有相應(yīng)的色譜峰，且與雜質(zhì)峰得到較好的分離，見圖1。

2.5 線性關(guān)系的考察

依次精密吸取混合對照品溶液2、5、10、20、30、50 μL 注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積s 的常用對數(shù)(Y)對進(jìn)樣量(μg)的常用對數(shù)(X)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，對照品在3. 968 ～99.200 μg 線性關(guān)系良好，回歸方程為:y =1. 5 ×10-6x-2.458 2，r=0.997 3。

圖1 對照品及樣品HPLC 圖

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液10 μL，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，以峰面積計(jì)算其精密度，RSD 為0.425%。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次(安徽20120701)澤蘭藥材6份，每份3.0 g。按“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行操作，制得6份供試品溶液。分別取20 μL 注入液相色譜儀進(jìn)行測定，結(jié)果得樺木酸含量平均值(n =6)為11.740 mg，RSD 值為1.932%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次(安徽20120701)供試品溶液分別于0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣20 μL，測定峰面積。結(jié)果得樺木酸峰面積的RSD(n =5)為1.382%。表明供試品溶液在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，本方法有良好的穩(wěn)定性。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量(樺木酸的含量為0.324%)的澤蘭粉末(安徽20120701)6 份，每份0.6 g。分別向其中加入樺木酸的對照品2 mg。按“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行操作，最后濃縮提取液并加甲醇定容至10 mL 容量瓶中，制得6 份加標(biāo)溶液，分別進(jìn)樣20 μL，結(jié)果得到樺木酸的平均回收率(n =6)為100.87%，RSD 為1.74%。結(jié)果見表1。

2.10 樣品測定

取不同批次的樣品各3 份，精密吸取按“2.3”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液，進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中樺木酸的平均含量，結(jié)果見表2。

表1 樣品回收率測定結(jié)果

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的選擇。分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水4 個(gè)溶劑系統(tǒng)。結(jié)果表明采用甲醇-0.2%磷酸水等度洗脫，樺木酸的在樣品中的峰形和分離度均達(dá)到要求。為保證色譜峰定性的準(zhǔn)確性，除上述流動(dòng)相外，還采用甲醇-0.2%磷酸水溶液(70∶30)、乙腈-0.2%磷酸水溶液(65∶35)作為流動(dòng)相，進(jìn)行了樣品與對照品的定性比較，結(jié)果在不同洗脫條件下，樣品均有相同的色譜峰與對照品對應(yīng)。

3.2 檢測波長的選擇。樺木酸的紫外掃描結(jié)果表明，在202 nm 處有最大吸收，且無其他成分干擾，所以選定檢測波長為202 nm。

3.3 樣品提取方法的選擇。根據(jù)對照品的溶解性，選擇以乙醇為溶劑?？疾炝思状假|(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取方式、時(shí)間、溫度和提取次數(shù)、對樣品中所測成分的影響，以樺木酸的峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明:95%乙醇熱回流提取4 h 為最佳提取條件。

3.4 不同批次藥材的含量分析。對采自安徽和江蘇的10 批藥材進(jìn)行含量測定后發(fā)現(xiàn)，所有批次的藥材中均含有樺木酸。但是由于采收時(shí)間不同，導(dǎo)致不同批次中樺木酸含量有差異。同時(shí)貯存方法、種植條件等也會(huì)對樺木酸的含量產(chǎn)生影響。

本研究首次建立了RP -HPLC 法測定澤蘭中樺木酸含量的方法。該方法準(zhǔn)確、靈敏，可為建立澤蘭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典:一部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:212.

［2］ 孫連娜，陳萬生，陶朝陽.澤蘭化學(xué)成分的研究Ⅱ［J］. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，20(3):172.

［3］ Toshihiro M，Mai W，Yu T，et al. Hyaluronidase inhibitors from takuran，Lycopus lucidus［J］. Chem pharm Bull，2010，58(3):394.

［4］ 聶波.澤蘭及地筍活性成分的研究［D］.北京中醫(yī)藥大學(xué)博士論文，2006.

［5］ 王濤，李超，濮社班，等.澤蘭的化學(xué)成分研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(5):83 -85.