支原體肺炎患兒肺泡表面活性物質(zhì)蛋白A基因多態(tài)性研究

許明峰，馮羅華，潘樂英，吳 曄

支原體肺炎(MP)是肺炎支原體引起的一種間質(zhì)性肺炎，常見于5歲以上兒童，近年來其發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1-2]，且多見嬰幼兒感染。肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(SP)是由肺泡2型細(xì)胞分泌產(chǎn)生的[3]，其中肺泡表面活性物質(zhì)蛋白A(SP-A)是目前研究最多的一種，其作為生物學(xué)標(biāo)志在肺部疾病中有著重要意義[4]。本研究通過檢測MP患兒及非MP患兒的血樣，測定SP-A基因序列，比較rs1059054、rs1136452及rs1136454位點的基因多態(tài)性，旨在探討SP-A基因多態(tài)性與MP患兒易感性的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2011年1—12月在我院住院的MP患兒100例為病例組，其中男58例，女42例；年齡6個月～14周歲；診斷依據(jù)衛(wèi)生部2009年版兒科臨床路徑中兒童MP臨床路徑：臨床癥狀及胸部X線片、胸部CT檢查診斷為肺炎，咽拭子肺炎支原體分離培養(yǎng)陽性，痰培養(yǎng)無其他細(xì)菌生長。選擇同期在我院住院的非MP患兒100例為對照組，其中男63例，女37例；年齡13個月～14周歲；咽拭子肺炎支原體分離培養(yǎng)均為陰性，痰培養(yǎng)有或無其他細(xì)菌生長。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集兩組患兒入院明確診斷后抽取血液標(biāo)本，檸檬酸鈉抗凝，采用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，-70 ℃保存?zhèn)溆?；試劑盒由生工生物工?上海)股份有限公司提供。

1.2.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)rs1059054位點上游引物為CTGGAGCCCCTGGTATCCCTGGAGAG，下游引物為GTGGAGAGAAGGGGGAGCCTGGCGA；rs1136452位點上游引物為CTGGAGAGTGTGGAGAGAAGGGGGAG，下游引物為CTGGCGAGAGGGGCCCTCCAGGTGA；rs1136454位點上游引物為GGAGAGAAGGGGGAGCCTGGCGAGAG，下游引物為GGCCCTCCAGGTGAGCAGGGTGGGG。引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以基因組DNA為模板在50 μl體系內(nèi)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，基因頻率使用直接計數(shù)法統(tǒng)計；Hardy-Weinberg平衡的符合程度和基因型分布的比較采用χ2檢驗；等位基因分布采用優(yōu)勢比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SP-A基因突變位點測序結(jié)果+186位點共計220個堿基對，病例組rs1059054、rs1136452及rs1136454位點變異頻率較高：rs1059054位點表現(xiàn)為純合子CC、純合子TT及雜合子CT(見圖1A)；rs1136452位點表現(xiàn)為純合子CC、純合子GG及雜合子CG(見圖1B)；rs1136454位點表現(xiàn)為純合子AA、純合子GG及雜合子AG(見圖1C)。

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗對照組和病例組rs1059054、rs1136452及rs1136454位點基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，具有群體代表性(見表1)。

2.3SP-A基因型分布兩組rs1059054位點CC、CT、TT基因型分布及C、T等位基因分布比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組rs1136452位點CC、CG、GG基因型分布及C、G等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組rs1136454位點AA、AG、GG基因型分布及A、G等位基因分布比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

注：A為rs1059054位點，B為rs1136452位點，C為rs1136454位點

圖1SP-A基因突變位點測序圖

Figure1Mutations of the SP-A gene sequencing graph

表1　兩組rs1059054、rs1136452及rs1136454位點基因型分布的Hardy-Weinberg平衡(例)

表2　SP-A基因型分布及等位基因分布(例)

注：*為χ2值

3　討論

肺炎支原體是一種常見的兒童呼吸道感染病原體，MP多見于學(xué)齡兒童，常年均有發(fā)病，臨床表現(xiàn)多樣，除肺部癥狀外，可表現(xiàn)為多種肺外表現(xiàn)[5]。本研究中病例組患兒出現(xiàn)較多的肺外表現(xiàn)有心肌損害、胸膜炎、皮疹及肝功能損害等，且嬰幼兒患兒例數(shù)明顯增多，有15例患兒年齡<3周歲，年齡最小者僅6個月。MP因其反復(fù)性、病程長、肺外并發(fā)癥多等而使患兒病情更加復(fù)雜，早期診斷和治療尤其重要。臨床一般通過測定肺炎支原體抗體和支原體培養(yǎng)以明確診斷，但支原體抗體一般在發(fā)病后1周陽性率才較高、1～4周為高峰期。本研究選用咽拭子肺炎支原體分離培養(yǎng)結(jié)果作為診斷依據(jù)，具有快速、早期發(fā)現(xiàn)率高的優(yōu)點，其快速鑒定培養(yǎng)基為一種人工合成液體培養(yǎng)介質(zhì)，組成材料是肺炎支原體結(jié)構(gòu)繁殖所需的蛋白質(zhì)、磷脂、碳水化合物、膽固醇、微量元素及復(fù)合抑菌因子等混合而成，營養(yǎng)豐富、特異性強，作用機制是快速繁殖增長的肺炎支原體分解葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH降低，產(chǎn)生顏色變化來判斷肺炎支原體生長，血樣中其他細(xì)菌則因培養(yǎng)基中加入了青霉素、醋酸鉈和生物抑菌劑等而被抑制[6]。MP的治療現(xiàn)在通用的為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，但關(guān)于其治療的療程并無定論，療程不足存在病情反復(fù)風(fēng)險，而療程過長存在肝功能損傷、消化系統(tǒng)反應(yīng)等不良反應(yīng)，給患兒及其家長帶來了痛苦。

SP存在于肺泡表面，約占肺泡表面活性物質(zhì)(PS)的10%，其余90%為脂類及磷脂[7]。SP除能降低肺泡表面張力外，還起著介導(dǎo)宿主防御及炎癥反應(yīng)等作用，其中以SP-A表達(dá)最強烈，且信號最豐富，在調(diào)節(jié)肺表面活性物質(zhì)代謝[8-9]、基因表達(dá)、肺內(nèi)免疫及炎癥反應(yīng)方面具有十分重要的作用[10]，而SP-A的表達(dá)水平與某些肺部疾病直接相關(guān)[11-12]，很多學(xué)者在肺部疾病中探討過SP-A作為生物學(xué)標(biāo)志的意義[13]。目前，臨床上可以通過檢測血液、肺泡灌洗液、痰液中SP-A水平指導(dǎo)臨床診治及判斷預(yù)后，具有非常重要的意義。

在SP-A基因中有許多突變位點，最常見的位點為+186、+655、+667位點。本研究對+186位點(引物序列為F:TTTTCTCTGCAGGCCCCATGGGTGC；R:GGGTTTGTCTGATCCCCATC)測序后，得到220個堿基對序列，再仔細(xì)閱讀發(fā)現(xiàn)變異頻率較多的位點分別為rs1059054、rs1136452及rs1136454。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，病例組與對照組rs1059054、rs1136454位點基因型及等位基因的分布存在差異，而rs1136452位點則無差異，初步證明SP-A基因rs1059054、rs1136454位點的多態(tài)性與MP的發(fā)病有一定相關(guān)性，但這兩個位點所表達(dá)的蛋白及其突變?nèi)绾斡绊懙鞍椎谋磉_(dá)仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，SP-A與許多肺部疾病密切相關(guān)，肺泡灌洗液中SP-A的水平檢測可作為判斷肺炎病情輕重程度的指標(biāo)，并可作為臨床上使用PS制劑替代療法的理論依據(jù)；患兒SP-A基因多態(tài)性可能與MP的發(fā)病有關(guān)。但由于現(xiàn)在市場上PS制劑價格昂貴，暫時不可能作為治療重癥MP患兒的常規(guī)手段，距離臨床推廣應(yīng)用還存在一定差距。同時由于技術(shù)原因，本研究未能對患兒肺泡灌洗液及肺泡SP-A水平進(jìn)行定量分析或設(shè)置對照，有待于在今后的研究中進(jìn)一步深入探索。

1李秋實.2009年我市兒童肺炎支原體肺炎流行情況[J].中國社區(qū)醫(yī)師：醫(yī)學(xué)專業(yè)，2011，13(11)：281.

2楊征，吳亞軍，安靜，等.嬰幼兒肺炎支原體肺炎63例臨床特點研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2011，19(12)：2110.

3厲敏香，范錚，方成超.小兒肺炎支原體肺炎診治體會[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(3)：996.

4戴長宗，王德明.肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A及其對肺的影響[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2011，9(19)：12-14.

5周國棟，周紅.沐舒坦對小兒支原體肺炎治療的增效作用[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，17(2)：211-213.

6錢新宏，張國成，許東亮.肺炎支原體鑒定培養(yǎng)基在兒童支原體感染快速診斷中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，21(5):71-72.

7靳玉紅.肺表面活性物質(zhì)治療新生兒呼吸窘迫綜合征療效分析[J].實用心腦肺血管病雜志，2011，19(12)：2025.

8Strayer DS，Pinder R，Chander A.Receptor-mediated regulation of pulmonary surfactant secretion[J].Exp Cell Res，1996，226(1)：90-97.

9楊一民，李蕙，陳四文，等.肺表面活性物質(zhì)治療早產(chǎn)兒呼吸窘迫綜合征及其影響機械輔助通氣方式的臨床研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(11)：3807.

10Borron P，Veldhuizen RA，Lewis JF，et al.Surfactant associated protein-A inhibits human lymphocyte proliferation and IL-2 production[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2006，15(1)：115-121.

11謝俊剛，徐水健，張珍祥，等.肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2005，22(1)：91-93.

12劉素云，董琳，萬春杰，等.肺表面活性蛋白A基因多態(tài)性與呼吸道合胞病毒下呼吸道感染的相關(guān)性研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2011，19(4)：12-15.

13Hall-Stoodley L，Watts G，Crowther JE，et al.Mycobacterium tuberculosis binding to human surfactant proteins A and D，fibronectin and small airway epithelial cells under shear conditions[J].Infect Immun，2006，74(6)：3587-3596.