阿霉素誘導的心力衰竭小鼠心臟去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白的表達變化*

靳文英， 喬正國， 鄭春華 ，李素芳， 陳紅

阿霉素誘導的心力衰竭小鼠心臟去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白的表達變化*

靳文英， 喬正國， 鄭春華 ，李素芳， 陳紅

目的： 觀察阿霉素誘導的充血性心力衰竭（心衰）小鼠心臟去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白（NET）的表達變化。

去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白；阿霉素；充血性心力衰竭；交感神經(jīng)

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:458.)

在心力衰竭（心衰）的發(fā)生發(fā)展中，交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活是加重心功能惡化的重要因素。去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白（NET）位于腎上腺素能神經(jīng)突觸前膜上，屬于單胺類 Na+/Cl-依賴性轉(zhuǎn)運蛋白，其功能是將神經(jīng)元釋放的去甲腎上腺素（NE）再攝取回突觸前膜內(nèi)，對調(diào)控突觸間隙中的NE濃度、終止神經(jīng)沖動信號、維持受體對神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性極 為 重 要[1,2]。 既 往 研 究 發(fā) 現(xiàn) 心 衰 時 存 在 有 心 臟NET 的表 達和功 能異常[3-6]， 其介導 的 NE 再攝取減少，可能在心衰的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。既往研究多采用主動脈結(jié)扎或心室快速起搏的方式來制備心衰動物模型，但手術操作可能損傷心臟附近的交感神經(jīng)纖維，而手術打擊和心室快速起搏均會刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮，有可能會影響交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的測定。本研究利用阿霉素誘導的充血性心衰小鼠動物模型，在不影響交感興奮性的前提下觀察心衰早期 NET在心臟的表達變化。

1 材料與方法

慢性充血性心衰小鼠模型的建立：雄性C57BL/6J 小 鼠 共 20 只， 年 齡 3～4 周， 體 重（25.5±2.8）g。分 為對照組和 阿霉 素組各 10 只。參 照 Teraoka 的方 法[7]，阿霉 素組小鼠給予鹽酸阿霉素（輝瑞制藥有限公司 ）腹腔注射 2 mg/kg，每 3天注射一次共 5次，以后則每 7天注射一次共 6次，累計用量 22 mg/kg；對照組小鼠給予腹腔注射同等量的生理鹽水。兩組小鼠均正常飲食喂養(yǎng)，第10周末做為實驗終點。行超聲心動圖檢查檢測小鼠心功能。支配小鼠心臟的交感神經(jīng)節(jié)主要發(fā)自頸中—星狀神經(jīng)節(jié)復合體（middle cervical-stellate ganglion complex, MC-SGC），而 心 臟交 感 神經(jīng) NET mRNA在 MC-SGC 中表達，NET 則通過軸突運送至心臟的交感神經(jīng)末梢突觸前膜上[8]。小鼠過量麻醉處死后，剪開胸腔暴露心臟及主動脈，于頸部中央分離雙側(cè)頸動脈旁的頸交感神經(jīng)干，向下分離至主動脈弓，摘取頸交感神經(jīng)節(jié)，并迅速摘取小鼠心臟，分別置于液氮中速凍，分離的頸交感神經(jīng)節(jié)和心臟標本均凍存于 -70℃待測。分別稱量每只小鼠心臟和體重，計算心臟重量與體重之比（HW/BW）。

超聲心動圖：應用超聲心動圖儀（飛利浦公司 IE33）及 15 MHz 高頻探頭，小鼠半量麻醉，保持自主呼吸，于胸骨旁乳頭肌水平短軸切面采集左心室二維圖像，獲得二維引導下 10個心動周期的M型超聲心動圖記錄。測量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDd），收縮末期內(nèi)徑（LVDs）以及室間隔厚度（IVSd）和左心室后壁厚度（LVPWd），計算左心室舒張末期容積（LVEDV），LVEDV=7×LVDd3/ (2.4+LVDd)；左 心 室 收 縮 末 期 容 積（LVESV），LVESV=7×LVDs3/(2.4+LVDs)；并計算左心室射血分數(shù)（LVEF，%）=(EDV-ESV)/EDV，左心室短軸縮短率（FS，%）=（LVDd- LVDs）/LVDd；左心室質(zhì)量 (LV mass) =1.05[(IVS+LVPWd+LVDd)3-LVDd3]。

實 時 熒 光 定 量 PCR 檢 測 mRNA 的 表 達：小 鼠NET mRNA 表達于支配心臟的頸交感神經(jīng)節(jié)中，心臟的β1腎上腺素能受體則分布在心臟交感神經(jīng)末梢內(nèi)，取冰凍的頸交感神經(jīng)節(jié)（MC-SG 復合體）和心 臟 組 織 勻 漿 后，Trizol法 提 取 組 織 總 RNA， 溶于 無 RNA 酶 水 中。 采 用 東 洋 坊 RT-PCR 試 劑 盒（TOYOBO，大阪，日本）逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應獲得 cDNA， 實 時 熒 光 定 量 PCR(PCR 分 析 儀：DNA Engine OpticonR，Bio-Rad； 分 析 軟 件：Opticon Monitor 3, Bio-Rad)測定 mRNA 含量。NET 引物序列為：上游 5’-GCACCTCCATTCTGTTTGCGGT-3’；下 游 5’-GCTCAACGAACTTCCAACACAGC -3’； 腎 上 腺 素 能 受 體 β1-AR 引 物 序 列：上游 5’-TGTGACGGCCAGCATCG-3’; 下 游5’-GCAGGCTCTGGTAGCGAAA-3’； 內(nèi) 參 對照 采 用 磷 酸 甘 油 醛 脫 氫 酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)， 引 物 序 列 為上 游 5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’ ， 下游 5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’。 反 應條 件 為：預 變 性 94℃ 3min， 變 性 94 ℃ 15 s， 退火 60 ℃ 15 s， 延 伸 72 ℃ 15 s， 共 40 個 循 環(huán)。以 GAPDH 作 為 內(nèi) 參， 計 算 相 對 表 達 量 =2-△Ct，△ Ct=Ct（ 目 的 基 因 ）-Ct（ 內(nèi) 參 基 因 ）。Ct值 為每個反應管內(nèi)的熒光信號到達閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

Western Blot法 測 定 心 肌 蛋 白 的 表 達：取 適量冰凍心肌組織，應用 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟 PMSF）提取心肌組織總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司 ）測定蛋白濃度[9]；加入十二烷基磺酸鈉（SDS）上樣緩沖液，100℃變性；進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；室溫封閉 2 h 后，將 PVDF 膜與一抗室溫下孵育 1h 并 4℃過夜，然后二抗室溫下孵育 1h；超敏化學發(fā)光法（ECL）顯影， 應 用 Bio-Rad 凝 膠 圖 像 成 像 系 統(tǒng) 和 Quality one 軟件進行掃描分析。兔抗鼠 NET 抗體購自Alomone 公司（Alomone Labs, 耶路撒冷，以色列 ），兔抗鼠 TH 抗體購自 Abcam 公司（劍橋市，馬薩諸塞州，美國）。

免疫組織化學染色：將小鼠心臟用 OCT包埋劑（SAKURA，洛杉磯，美國）包埋，于 -23℃切成 12 μm 厚的冰凍切片。取小鼠左心室冰凍切片，將 切 片 在 預 冷 的 10% 甲 醛 溶 液 中 固 定 10 min，PBS 磷酸鹽緩沖液（135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8 mM K2HPO4, pH7.4）沖洗 3 次，滴加血清封閉液封閉 30 min 后，一抗 4℃過夜，常溫 復 溫 30 min，PBS 沖 洗 3 次；二 抗 37 ℃ 孵 育20 min，PBS 沖洗 3 次后滴加 SABC 溶液 20 min，PBS沖洗 3次，二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）顯色，蒸餾水沖洗，脫水，透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察（Leica DM 4000B）。SABC（鏈霉親和素—生物素復合物）免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司，Masson 染色試劑盒購自上海江萊生物公司，并按照試劑盒說明書進行染色[10]。

統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，使用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。對兩組均數(shù)的比較采用兩樣本的t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

兩組小鼠臨床及超聲結(jié)果：兩組小鼠分別腹腔注射阿霉素和生理鹽水，在實驗第 10周末，對照組小鼠生長良好，體重 (27.68±1.96) g，精神狀態(tài)好。阿霉素組小鼠 10周末死亡 2只，存活的 8 只小鼠體重（23.52±1.62） g，較對照組明顯減輕（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義，且存在精神萎靡的表現(xiàn)，但兩組小鼠心臟/體重比值無明顯變化。行超聲心動圖檢查測定小鼠左心室收縮末及舒張末內(nèi)徑，并計算心功能指標。阿霉素組小鼠經(jīng)小劑量多次阿霉素腹腔注射后，與對照組比較心肌運動幅度明顯減弱（圖1），左心室射血分數(shù)、左心室短軸縮短率明顯降低，左心室收縮末期內(nèi)徑、左心室舒張末容積、左心室質(zhì)量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05～0.01，表1），Masson 染色提示阿霉素組小鼠心肌纖維化較對照組增多（圖2）。

心衰小鼠心臟 NET的 mRNA 表達：實時熒光定量 PCR 的方法測定小鼠頸交感神經(jīng)節(jié)中 NET 的 mRNA表達量無明顯變化。同時我們檢測了心臟腎上腺素能受體 β1-AR 的表達，結(jié)果顯示心衰小鼠心臟 β1-AR 的 mRNA 表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

阿霉素組心衰小鼠心臟 NET的蛋白表達：采用Western blot方法檢測小鼠心臟中 NET 的蛋白表達量。如圖3所示，阿霉素組小鼠心臟組織NET的蛋白表達量明顯較對照組降低（P＜0.05），并且 NE 合成限速酶酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的蛋白表達量顯著增加（圖3，P＜0.05）。進一步用免疫組化方法檢測TH染色陽性的交感神經(jīng)纖維密度，如圖4所示，阿霉素組和對照組小鼠心臟交感神經(jīng)纖維密度沒有明顯差異。

表1 小鼠超聲心動圖測量指標（±s）

圖1 實驗第 10 周末小鼠 M 型超聲心動圖

圖2 小鼠左心室 Masson 染色

圖3 小鼠心臟中 NET 和 TH 的蛋白表達

圖4 小鼠左心室交感神經(jīng)纖維密度

3 討論

在心衰的發(fā)生發(fā)展中，交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活是加重心功能惡化的重要因素。目前一致認為，阻斷神經(jīng)內(nèi)分泌的過度激活，防治心肌重構是 治 療 心 衰 的 關鍵[11,12]。NET 位 于 交 感 神 經(jīng) 突觸前膜上，對神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控具有重要作用，但其在心衰中的作用尚不清楚。本文研究結(jié)果證實在阿霉素誘導的慢性充血性心衰小鼠模型中，在交感神經(jīng)纖維密度無明顯變化的心衰早期，小鼠心臟 NET 的蛋白表達量下調(diào)，TH 蛋白表達增加，提示心衰早期時 NET 的表達下調(diào)可導致 NE 再攝取減少，心臟 NE蓄積致突觸前NE儲備耗竭，NE的合成代償性增加。

既往研究多采用主動脈結(jié)扎或心室快速起搏來制備心衰動物模型，但手術操作可能損傷心臟附近的交感神經(jīng)纖維，而手術打擊和心室快速起搏均會刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮，有可能會影響交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的測定。阿霉素具有很強的心臟毒性，其累積的毒性可導致中毒性心肌炎、心肌病和心律失常，最終誘發(fā)充血性心衰，在不影響交感活性前提下是較好的研究容量超負荷心衰的動物模型。在我們的阿霉素誘導心衰小鼠模型中，心衰小鼠心臟NET mRNA 水平?jīng)]有變化，但蛋白表達量下降，表明心衰時 NET 存在轉(zhuǎn)錄后的下調(diào)。這與既往研究的報道一致：在主動脈縮窄術致充血性心衰的大鼠模型中，心臟 NET mRNA 表達不變，但心臟 NET再攝取功能受損，交感神經(jīng)末梢 NET 蛋白表達和活性降低[13]。心衰 時 NET 存 在轉(zhuǎn)錄后蛋 白表達 的調(diào)控，這個調(diào)控可以是量的變化，也可以是細胞內(nèi)靶向定位的改變。mRNA 代表基因轉(zhuǎn)錄水平，蛋白代表翻譯水平，表示功能。從 mRNA 到翻譯成蛋白的過程會受到不同水平的調(diào)控，而且蛋白磷酸化等一系列轉(zhuǎn)錄后修飾過程可導致蛋白水平的差異，例如蛋白的降解，另外一種情況則是翻譯后的蛋白不能有效運送至突觸前膜上。我們的研究結(jié)果表明，阿霉素誘導的充血性心衰小鼠心臟 NET蛋白表達下調(diào)，NE的合成限速酶TH蛋白表達顯著增加，表明心衰時 NET再攝取功能障礙導致 NE 在心臟的儲備耗竭，NE 代償性合成增加。但 NET mRNA和交感神經(jīng)纖維密度沒有變化，β腎上腺素能受體未見明顯變化，提示在心衰早期即可出現(xiàn) NET的再攝取功能障礙。

NET是位于中樞和外周腎上腺素能神經(jīng)突觸前膜上的 Na+、Cl-依賴性轉(zhuǎn)運蛋白家族成員之一，與多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白（DAT）、5 羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白、γ氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白等具有高度同源性。NET 由 617個氨基酸組成，分子量 60～85 kDa[2]。80%～90% 的去甲腎上腺素由 NET再攝取，對于調(diào)控突觸間隙和腎上腺素能受體周圍的 NE 濃度，終止 NE 作用，維持受體對神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性起著至關重要的作用[1,2]。 交感 神 經(jīng)系 統(tǒng) 活性 調(diào) 節(jié)紊 亂 是心 血 管疾病 的重要病理機制之一。交感神經(jīng)支配的器官中，心臟NET的分布和 NE 再攝取的效率明顯高于其他如腎臟 和骨 骼肌等器官[1,2]。直 立性心動過 速綜合征患者 存 在 NET 基 因 缺 陷，NE 再 攝 取 功 能障礙[14,15]。在人體和動物研究中均已證實了 NET 表達和活性的 改變參與心衰的 發(fā)生發(fā)展[3-6]。心衰時心臟 NET介導的NE再攝取功能障礙，細胞外間隙長期慢性持續(xù)性NE的蓄積導致腎上腺素能受體的過度激活，并 誘 導心 肌肥厚 和心 室重構[16]。 而交 感 神經(jīng) 的過度激活和腎上腺素能受體的表達下調(diào)正是β腎上腺素能受體阻滯劑治療心衰的病理基礎，但β受體阻滯劑發(fā)揮療效需要數(shù)月的時間，對 NET 表達和功能調(diào)控機制的進一步研究有助于促進心衰的診治進展。研究顯示 NET表達和活性的降低發(fā)生在心 衰 早期[5]， 動物實 驗 證實 增 加 NET 的表 達 或改善其功能可以改善心室重構和心功能：在心衰兔模型中利用轉(zhuǎn)基因技術于心肌中過表達 NET 可以增加 NE的再攝取，結(jié)果顯示左心室內(nèi)徑縮小，射血分 數(shù)增 加， 同時心肌 β 受體的 下調(diào) 被逆轉(zhuǎn)[17]；而在心衰大鼠星狀神經(jīng)節(jié)中注射神經(jīng)生長因子可以增加 NE 的再攝取，改善左心室功能[18]。心臟移植前患者經(jīng)左心室輔助裝置治療后心功能改善的同時伴隨 NET 蛋 白 表達 的 顯著 增 加[6]。小 劑 量卡 維 地洛在充血性心衰患者中使用1周，在不影響腎上腺素能受體的同時可以降低患者靜息和運動后的NE濃度，提示卡維地洛有可能可以改善 NET 的功能[19]。以上研究均證實 NET 的表達和活性調(diào)控很有可能是心衰治療的新靶點。

基于以上研究基礎，我們證實在不影響交感興奮性的前提下，阿霉素誘導的充血性心衰小鼠心臟NET的表達下調(diào)，心衰早期即可發(fā)生 NE 再攝取功能的障礙，NE代償性合成增加，交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活形成惡性循環(huán)。NET的表達和調(diào)控在多種疾病包括精神、神經(jīng)系統(tǒng)及心血管疾病中發(fā)揮著重要作用。對 NET表達和功能的調(diào)控機制的進一步探討有利于心衰的診治進展。

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Protein Expression Changes of Norepinephrine Transporter in Adriamycin Induced Congestive Heart Failure Mice model

JIN Wen-ying, QIAO Zheng-guo, ZHENG Chun-hua, LI Su-fang, CHEN Hong.
Department of Cardiology, Peking University People’s Hospital, Beijing (100044), China

CHEN Hong, Email: chenhong0418@yahoo.com.cn

Objective: To observe the protein expression changes of norepinephrine transporter (NET) in adriamycin induced congestive heart failure (CHF) mice model.Methods: The adriamycin induced CHF mice model was established, the heart tissue and middle cervical-stellate ganglion complex (MC-SGC) were isolated. The mRNA expression of NET and adrenergic receptor (β1-AR) was detected by RT-PCR, the protein expression of NET and tyrosine hydroxylase (TH) was measured by Western blot analysis, and the cardiac sympathetic nerve fibers were examined with immunohistochemistry.Results: ① The mRNA expression of NET and β1-AR was unchanged in stellate ganglion in CHF mice. ② The protein expression was decreased in NET and increased in TH. ③ The density of sympathetic nerve fibers were unchanged in the early stage of CHF in mice model.Conclusion: The protein expression of NET was down-regulated and the unbalanced activity of sympathetic nerve may worsen the cardiac function in CHF mice model.

Norepinephrine transporter; Adriamycin; Congestive heart failure; Sympathetic nerve

2013- 06-03）

（編輯：汪碧蓉）

國家自然科學基金資助項目（No.31000472）

100044 北京市， 北京大學人民醫(yī)院 心臟中心

靳文英 主治醫(yī)師 博士 從事心血管疾病的基礎和臨床研究 Email：jjwyy@sina.com 通訊作者：陳紅 Email： chenhong0418@yahoo.com.cn

R54

A

1000-3614（2013）06-0458 -05

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.06.015

方法： 建立阿霉素誘導的充血性心衰小鼠動物模型，分離小鼠心臟和頸交感神經(jīng)節(jié)，實時熒光定量多聚酶鏈反應（PCR）的方法檢測 NET 和腎上腺素能受體 β1-AR 的 mRNA 表達，用 Western blot方法檢測 NET 和酪氨酸羥化酶（TH）的蛋白表達。免疫組化方法染色心臟交感神經(jīng)纖維。

結(jié)果：①心衰小鼠心臟交感神經(jīng)節(jié)中 NET 和 β1-AR 的 mRNA 表達無明顯變化。②心衰小鼠心肌組織中 NET 的蛋白表達顯著降低，而TH的蛋白表達上調(diào)。③心衰早期小鼠心肌交感神經(jīng)纖維密度無明顯變化。

結(jié)論： 充血性心衰小鼠心臟 NET 的蛋白表達存在轉(zhuǎn)錄后的下調(diào)，心衰早期 NET 的表達下調(diào)可導致 NE 再攝取障礙，交感神經(jīng)活性失衡從而加劇心功能的惡化。