模擬肽 L-4F 對動脈粥樣硬化小鼠的保護作用及機制*

應(yīng)如，袁勇，秦亞飛，馮力，田迪，郭志剛，李明星

·基礎(chǔ)與實驗研究·

模擬肽 L-4F 對動脈粥樣硬化小鼠的保護作用及機制*

應(yīng)如，袁勇，秦亞飛，馮力，田迪，郭志剛，李明星

目的：觀察載脂蛋白 A-1（Apo A-1）模擬肽 L-4F（L-4F）與辛伐他汀比較對載脂蛋白 E 基因敲除 (Apo E-/-) 小鼠動脈粥樣硬化及膽固醇流出率的影響，并探討其可能的機制。

動脈粥樣硬化；膽固醇流出率；載脂蛋白 A-1 模擬肽；高密度脂蛋白

(Chinese Circulation Journal, 2013,28: 379.)

動脈粥樣硬化所致缺血性心血管疾病是中老年人群發(fā)病和死亡的常見原因。他汀類藥物有效防治動脈粥樣硬化的作用，已在臨床廣泛使用。盡管他汀類藥物能有效降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），卻僅能減少三分之一的冠狀動脈（冠脈 ）事件發(fā)生[1]。因此，尋找其他有效的抗動脈粥樣硬化藥物勢在必行。研究發(fā)現(xiàn)，高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)水平與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展呈 負 相 關(guān)， 具 有 心 血 管 保 護 功 能[2]。 然 而， 疾 病狀態(tài)如急性冠脈綜合征患者高密度脂蛋白（HDL）中炎 性 蛋白 的增 加導 致 HDL 變 為失 功能[3]。載 脂蛋白 A-1（ApoA-1）是 HDL 的主要成分，在 HDL抗動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮重要作用，包括促進膽固醇流出[4]、抗炎抗氧化[4,5]和改善血管舒縮功能[6]等，其中促進膽固醇流出在抗動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。肝臟是膽固醇代謝的主要部位，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白 A1（ATP binding cassette transporter A1, ABCA1）、B 族 I 型 清 道 夫受體（Scavenger receptor class B type I , SR-BI）和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白 G1（ATP binding cassette transporter G1, ABCG1）是膽固醇流出的 3 種主要調(diào)節(jié)蛋白。

ApoA-1 模擬肽 具有和 ApoA-1 相 似的功 能，L-4F 是 一 種 高 生 物 活 性 的 ApoA-1 模 擬 肽[7]， 能夠促進膽固醇流出。然而，與他汀類藥物相比，模擬肽 L-4F（L-4F）對動脈粥樣硬化及膽固醇流出的影響國內(nèi)外鮮有研究。因此，本實驗研究 L-4F 及辛伐他汀對動脈粥樣硬化及膽固醇流出率的影響，進行比較，并觀察它們對肝臟 ABCA1、SR-BI及ABCG1 表達的影響，探討 L-4F 及辛伐他汀抗動脈粥樣硬化的機制。

1 材料與方法

主要試劑 ： L-4F 由深圳瀚宇藥物有限公司合成（氨基酸序列 DWFKAFYDKVAEKFK- EAF 為 18個氨基酸多肽），辛伐他?。?0 mg/片）購自默沙東制藥有限公司（美國 ）；RAW264.7 細胞購自廣州學友公司；3H- 膽固醇購自 PerkinElmer公司（美國 ）；8-Br- 環(huán)磷酸腺苷（cAMP）購自美國 Sigma 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO生物有限公司（日本）；熒光染料 SYBR@Premix Ex TagTMII購自日本 Takara公司；引物由 Invitrogen 公司（美國 ）合成；ABCA1、SR-BI一抗為美國 Novus公司產(chǎn)品，ABCG1 一抗為英國 Abcam 公司產(chǎn)品。

實驗?zāi)Ｐ偷慕⒑透深A(yù)：8 周齡健康雄性 Apo E-/-小鼠（購自南方醫(yī)科大學實驗中心 ）以高脂飲食（0.15% 膽固醇，21%豬油）分籠飼養(yǎng)，并隨機分為 3組，每組6只：①動脈粥樣硬化組：單純喂食高脂飲食；②辛伐他汀組：在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，予以每日灌服辛伐他汀 5 mg/(kg·d)；③ L-4F 組：在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，予以腹腔注射 L-4F 1 mg/(kg·d)[8,9]。以上給藥均在每日上午 9時，16周末麻醉各組小鼠，取各種標本。

血脂測定：小鼠空腹8小時狀態(tài)下，乙醚麻醉后心臟采血，用自動生化儀測定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇；用小鼠酶聯(lián)免疫法（ELISA）試劑盒測定血清載脂蛋白A-1濃度。

[3H]膽 固 醇 流 出 率 的 測 定：將 RAW264.7 細胞置于 24 孔細胞培養(yǎng)板（細胞終濃度 2×105/ml），分別以 DMEM 培養(yǎng)液（含 2% 胎牛血清 ）1 ml于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分別加入 [3H]膽固醇（終濃度 1μCi/ml）及乙酰化低密度脂蛋白 (Ac-LDL，終濃度 50 μg/ml)促進細胞對膽固醇吸收，同時將 8- 環(huán)磷酸腺苷（cAMP，0.3 mmol/L）加入其中共同孵育 6 h。培養(yǎng) 24 h 后去除培養(yǎng)基，并以 DMEM 培養(yǎng)液洗滌2次后，再次加入 DMEM 培養(yǎng)液（含 2% 胎牛血清）培養(yǎng) 18 h 后棄培養(yǎng)液。洗滌細胞后，將含小鼠血清（2%）的培養(yǎng)基加入細胞，促進 [3H]膽固醇轉(zhuǎn)出，其中設(shè)一對照孔加不含血清的培養(yǎng)基。4 h 后細胞用 PBS 平衡液洗滌并加入 1ml NaOH(0.1 mol/L)室溫孵育 30 min。液閃計數(shù)儀檢測細胞溶解物及細胞介質(zhì)的 [3H]放射量。[3H]膽固醇轉(zhuǎn)出率＝（加血清培養(yǎng)液放射量 - 未加血清培養(yǎng)基放射量）/總 CPM×100%。

主動脈粥樣斑塊面積的計算:自主動脈根部至髂動脈分叉處分離小鼠主動脈，然后縱行剖開觀察動脈內(nèi)膜斑塊形成情況，并用油紅O染色顯示動脈粥樣硬化斑塊，應(yīng)用 Image-Pro Plus Version 6.0 專業(yè)圖像分析軟件進行分析。主動脈斑塊面積以粥樣斑塊面積 (染為紅色 )占血管內(nèi)膜總面積的百分比表示。

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析肝臟 3種 mRNA 的表達 : 分別取各組小鼠肝臟 100 g，液氮中研磨組織，按 TRIzol試劑盒說明書提取 RNA，分光光度計測定 RNA含量和純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。用 SYBR@Green l嵌合熒光法在 AB7500 上進行 PCR 擴增。所有引物均參照 Gengbank 提供的序列。引物設(shè)計如下 :ABCA1 為5'-CTTCCCACATTTTTGCCTGG-3’（正義鏈）和 5’-AAGGTTCCGTCCTACCAAGTCC-3’（反義鏈 ）；SR-BI為 5'-GCAAATTTGGCCTGTTTGTT-3’（正義鏈 ）和 5'-GATCTTGCTGAGTCCGTTCC-3’（反義鏈 ）；ABCG1 為5'-CGAGAGGGCATGTGTGACG-3’（正義鏈 ）和5'- CCGAGAAGCTATGGCAACC-3（反義鏈 ）；β- 肌動蛋白為 5'-CAGATCATGTTTGAGACCTTCAAC-3’（ 正義鏈）和 5'- TCGAAGTCTAGAGCAACATAGCAC-3’（反義鏈）。由電腦自動分析并計算Ct值。選用 β 肌動蛋白作為內(nèi)參基因，采用 2-△(△Ct)法分析基因表達差異。

免疫印跡標記法分析肝臟3種蛋白的表達：分別取各組小鼠肝臟 100 g，液氮中研磨組織后，用RIPA 裂解液裂解組織，收集裂解的組織在 4℃下，12000 r /min 離心 5 min，BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白質(zhì)定量，用 5%十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)進行電泳分離，轉(zhuǎn) PVDF 膜。封閉液常溫封閉 1 h，加一抗 (ABCAl 1：500；SR-BI 1:1000；ABCG1 1:1000)，4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗 3 次，加辣根過氧化物酶標記二抗 (1：15000)，室溫孵育 1 h，TBST 緩沖液洗 3 次，用凝膠成像分析系統(tǒng)顯色并曝光顯影。

統(tǒng)計學處理：Image J 軟件分析 Western blot結(jié)果的灰度值。實驗所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，用 SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件包進行處理；數(shù)值變量多組間比較采用單因素方差分析；兩兩間比較方差齊時采用 LSD-t 檢驗，方差不齊時采用 Dunnett’s T3 法檢驗；檢驗水準為雙側(cè) α=0.05，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。相關(guān)分析采用 Pearson 積矩相關(guān)分析。

2 結(jié)果

血脂水平變化：16 周末，辛伐他汀組與動脈粥樣硬化組比較血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯降低，而高密度脂蛋白膽固醇水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05～0.01）；而 L-4F 組較動脈粥樣硬化組的 ApoA-1 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 16 周末小鼠血脂水平變化（n=6,±s）

膽固醇流出率：動脈粥樣硬化組膽固醇流出率 為 (16.82±0.39)%， 辛 伐 他 汀 組 膽 固 醇 流 出 率為 (20.55±0.98)% ， L-4F 組 干 預(yù) 后 膽 固 醇 流 出 率 為(22.47±1.16)%；L-4F 組與辛伐他汀組、動脈粥樣硬化組比較膽固醇流出率均增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；而辛伐他汀組與動脈粥樣硬化組相比膽固醇流出率也增高，差異也有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。（圖1）

圖1 膽固醇流出率 3 組結(jié)果比較

主動脈粥樣斑塊面積：與動脈粥樣硬化 組（44.30±11.85）% 相 比， 辛 伐 他 汀 組（19.77±1.95）% 和 L-4F 組（22.58±6.88）% 的主動脈粥樣斑塊面積均明顯減少（P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義。（圖2）

圖2 經(jīng)油紅 O 染色觀察的主動脈內(nèi)膜粥樣斑塊面積

肝臟 3 種 mRNA 的表達：動脈粥樣硬化組、L-4F組及辛伐他汀組肝臟均有 ABCA1、SR-BI、ABCG1 mRNA 表達，辛伐他汀組與動脈粥樣硬化組相比，ABCA1 和 ABCG1 mRNA 表達明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。L-4F 組三種 mRNA 表達較動脈粥樣硬化組均增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。（表2）

表2 肝臟 3 種 mRNA 的表達（n=6,±s）

肝臟3種蛋白的表達：動脈粥樣硬化組、L-4F 組及辛伐他汀組肝臟均有 ABCA1、SR-BI、ABCG1蛋白表達，辛伐他汀組較動脈粥樣硬化組ABCA1、ABCG1 蛋白表達增加（P＜0.001），L-4F組較動脈粥樣硬化組 ABCA1、SR-BI和 ABCG1蛋白表達增加（P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義。（圖3）

圖3 免疫印跡標記法檢測肝臟三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白 A1（ABCA1）、B族 I型清道夫受體 (SR-BI)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白 G1(ABCG1)蛋白表達

3 討論

冠心病是由冠狀動脈粥樣硬化引起的心肌缺血性疾病，脂質(zhì)代謝異常是動脈粥樣硬化主要原因之一[10]。大量基礎(chǔ)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，低密度脂蛋白膽固醇水平與冠心病的發(fā)生呈明顯正相關(guān)，低密度脂蛋白膽固醇水平的異常增高是冠心病發(fā)病的重要病因[11]。因此，降低低密度脂蛋白膽固醇濃度成為治療冠心病的重要靶點。他汀類藥物 (statins)是目前臨床使用最廣泛有效的調(diào)脂藥。他汀類藥物不僅能顯著降低低密度脂蛋白膽固醇和極低低密度脂蛋白膽固醇，還具有改善內(nèi)皮功能、抗炎抗氧化、抗血小板集聚和穩(wěn)定斑塊等功能[12]，具有抗動脈粥樣硬化作用。

與低密度脂蛋白作用相反，高密度脂蛋白具有抗動脈粥樣硬化作用。高密度脂蛋白主要功能包括促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運、抑制低密度脂蛋白氧化、改善內(nèi)皮細胞功能失調(diào)、抗炎、抗血栓及促纖溶等[13]。膽固醇逆轉(zhuǎn)運（RCT，reverse cholesterol transport）是周圍組織（包括動脈粥樣斑塊）游離膽固醇通過血漿脂蛋白轉(zhuǎn)運到肝臟進行再循環(huán)或是以膽酸的形式排泄的過程，包括細胞內(nèi)膽固醇的流出、膽固醇酯化和從體內(nèi)排泄[14]。其中，膽固醇流出是細胞內(nèi)游離膽固醇經(jīng)細胞膜的特定區(qū)域流出到細胞外的過程，是 RCT關(guān)鍵步驟。膽固醇流出率較高密度脂蛋白膽固醇更能代表高密度脂蛋白抗動脈粥樣硬化功能[2]，而在炎癥、脂質(zhì)紊亂以及代謝性疾病中，高密度脂蛋 白 抗動 脈 粥樣 硬 化特 性 會受 到 影響[15]。 本研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀不僅能降低低密度脂蛋白膽固醇水平，而且能改善動脈粥樣硬化小鼠的高密度脂蛋白功能，促進膽固醇流出，可能為其抑制動脈粥樣硬化的機制之一。

4F為目前生物活性最高的載脂蛋白 A1模擬肽，L-4F 為全部由左旋氨基酸合成，而 D-4F 為右旋氨基酸合成，目前認為二者除了受胃酶的影響（L-4F在胃腸道更易被蛋白酶水解，故不能口服，D-4F 則否 ）不同之外[16]，大部分作用和性質(zhì)是相似的，包括抗動脈粥樣硬化、抗炎抗氧化等。然而目前研究發(fā)現(xiàn) D-4F 具有促進膽固醇流出作用，而 L-4F 對膽固醇流出的影響國內(nèi)外都鮮有研究，本研究發(fā)現(xiàn)L-4F 能夠促進膽固醇流出，不僅說明促進膽固醇流出為 L-4F 抗動脈粥樣硬化的機制之一，也證實L-4F和 D-4F 均具有促進膽固醇流出的作用。同時本研究首次發(fā)現(xiàn) L-4F 較辛伐他汀促進膽固醇流出的作用強，但二者抗動脈粥樣硬化的作用無明顯差異，說明 L-4F 和辛伐他汀發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的主要機制存在差異。因此，L-4F 和他汀聯(lián)合使用可能發(fā)揮更有效的抗動脈粥樣硬化作用，為臨床抗動脈粥樣硬化提供新思路新途徑。

細胞內(nèi)膽固醇流出受多個跨膜轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)節(jié)，主 要包 括 ABCA1、SR-BI、ABCG1[17]。肝 臟 是參 與膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程中的關(guān)鍵部位，肝細胞 ABCA1、SR-BI和 ABCG1 在 RCT 過 程 中 發(fā) 揮 重 要 作 用。ABCA1 主要介導細胞內(nèi)游離膽固醇（FC）、磷脂及其他親脂分子通過胞膜轉(zhuǎn)運給貧脂載脂蛋白 A-1[18]。SR-BI介導 FC 的雙向轉(zhuǎn)運，既介導胞內(nèi)膽固醇流出，也介導肝細胞及相關(guān)組織細胞對 HDL膽固醇的攝取[19]。ABCG1 主要介導 FC 轉(zhuǎn)運給 成熟 HDL[20]。 本研究發(fā)現(xiàn) L-4F 能明顯地增加肝臟 ABCA1、SR-BI 和ABCG1 的 mRNA 及蛋白表達，可能為其促進膽固醇流出的主要機制。而辛伐他汀能增加肝臟 ABCA1和 ABCG1 的 mRNA 及蛋白表達，從而促進膽固醇流出。

綜上所述，L-4F 可通過增加肝臟 ABCA1、SRBI 和 ABCG1 表達，促進膽固醇流出，有效減少了主動脈粥樣斑塊面積。因此，L-4F 可能為治療動脈粥樣硬化提供新途徑。

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Protective Effect and Mechanism of Apolipoprotein A-1 Mimetic Peptide L-4F on Atherosclerosis in Mice Model

YING Ru, YUAN Yong, QIN Ya-fei, FENG Li, TIAN Di, GUO Zhi-gang, LI Ming-xing.
Department of Cardiology, Zhongshan Hospital, Sun Yat-sen University, Zhongshan (528403), Guangdong, China

YUAN Yong, Email：yuanyong1123@yahoo.com.cn

Objective: To observe the effects of apolipoprotein A-1 (Apo-A1) mimetic peptide L-4F (L-4F) and simvastatin on cholesterol efflux and atherosclerosis in Apo E-/-mice model.Methods: 8 weeks male Apo E-/-mice were randomly divided into 3 groups, Atherosclerosis (AS) group, the mice were treated with high fat diet, Simvastatin group, high fat diet+simvastatin, and L-4F group, high fat diet+ L-4F. n=6 in each group. All animals were treated for 16 weeks, and then, serum lipid level was recorded, Apo-A1 concentration was examined by ELISA, aortic AS plaque was observed by red O oil staining, cholesterol efflux was evaluated by liquid scintillationspectrometry. The mRNA and protein expression of liver ABCA1, SR-BI and ABCG1were detected by RT-PCR and Western blot respectively.Results: ① Compared with AS group, Simvastatin group presented decreased levels of TC, TG, LDL-C and increased HDL-C, P＜0.05～0.01, while L-4F group showed obviously increased Apo-A1 concentration, P＜0.05. ② Compared with Simvastatin group and AS group, L-4F group had increased cholesterol efflux, P＜0.001, compared with AS group, Simvastatin group also had increased cholesterol efflux, P＜0.001. ③ Compared with AS group, the other 2 groups had smaller AS plaque area, P＜0.001. ④ Compared with AS group, Simvastatin group presented increased protein expression of ABCA1 and ABCG1, P＜0.001 and L-4F group showed increased protein expression of ABCA1, SR-BI and ABCG1, P＜0.001.Conclusion: L-4F may promote cholesterol efflux by up-regulating ABCA1, SR-BI and ABCG1 expression in the liver, and therefore, attenuate the atherosclerosis in Apo E-/-mice model.

Atherosclerosis; Cholesterol efflux; Apolipoprotein A-1 mimetic peptide; High density lipoprotein

2013-04-17）

（編輯：梅平）

廣東省中山市科技計劃重大專項（20102A016）

528403 廣東省中山市，中山大學附屬中山醫(yī)院 心內(nèi)科（應(yīng)如、袁勇、秦亞飛、馮力、李明星 ）；南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院心內(nèi)科（田迪、郭志剛）

應(yīng)如 碩士研究生 主要從事血脂研究 Email：yingru2005@163.com 通訊作者：袁勇 Email：yuanyong1123@yahoo.com.cn

R541

A

1000-3614（2013）05-0379-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.05.017

方法：研究對象為 8 周齡雄性 Apo E-/-小鼠，分為 3 組：①動脈粥樣硬化組：以單純高脂飲食；②辛伐他汀組：高脂飲食基礎(chǔ)上予辛伐他汀治療；③ L-4F 組：高脂飲食基礎(chǔ)上予 L-4F 治療。在實驗第 16 周末取標本。用自動生化儀測定小鼠血脂水平，利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清 ApoA-1 濃度；油紅 O 染色分析主動脈粥樣斑塊面積；同時用液閃計數(shù)儀檢測膽固醇流出率；并采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫印跡標記法（Western blot）分析肝臟三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白 A1（ABCA1 ）、B 族 I型清道夫受 體（ SR-BI）和三磷酸腺苷結(jié)合 盒 轉(zhuǎn) 運 蛋 白 G1（ABCG1）mRNA 和蛋白表達水平。

結(jié)果：16 周末血脂變化：與動脈粥樣硬化組比較，辛伐他汀組血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯降低，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平明顯升高（P＜0.05～0.01）；而 L-4F 組較動脈粥樣硬化組的 ApoA-1水平明顯升高（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。膽固醇流出率：L-4F 組與辛伐他汀組、動脈粥樣硬化組比較膽固醇流出率均增高（P＜0.001），而辛伐他汀組與動脈粥樣硬化組相比膽固醇流出率也增高（P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義。主動脈粥樣斑塊面積：與動脈粥樣硬化組相比，辛伐他汀組、L-4F 組斑塊面積均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。肝臟 3 種蛋白的表達：辛伐他汀組較動脈粥樣硬化組 ABCA1、ABCG1 蛋白表達增加（P＜0.001），L-4F組較動脈粥樣硬化組 ABCA1、SR-BI 和 ABCG1 蛋白表達增加（P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義。

結(jié)論： L-4F 可能通過上調(diào)肝臟 ABCA1、SR-BI和 ABCG1 的 mRNA 和蛋白表達，促進巨噬細胞膽固醇流出，有效發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。