非諾貝特對(duì)壓力超負(fù)荷中期大鼠心肌能量代謝和心室重構(gòu)的影響*

何燕，鄔江濤，鐘國強(qiáng)，吳龍飛，李醒三，王炎，陳卓宏，閉奇

·基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究·

非諾貝特對(duì)壓力超負(fù)荷中期大鼠心肌能量代謝和心室重構(gòu)的影響*

何燕，鄔江濤，鐘國強(qiáng)，吳龍飛，李醒三，王炎，陳卓宏，閉奇

目的:研究非諾貝特對(duì)壓力超負(fù)荷中期大鼠心肌能量代謝和心室重構(gòu)的影響。

非諾貝特；肥厚；重構(gòu)；能量代謝；壓力超負(fù)荷

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:140.)

心臟壓力超負(fù)荷可導(dǎo)致一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)信號(hào)瀑布激活，產(chǎn)生適應(yīng)性應(yīng)答以維持正常心臟輸出。這種適應(yīng)包括心肌細(xì)胞質(zhì)量、基因表達(dá)和代謝的調(diào)整。在結(jié)構(gòu)水平，表現(xiàn)為心臟肥大；在轉(zhuǎn)錄水平，表現(xiàn)為胚胎期基因再表達(dá)，而多種成人期基因表達(dá)下調(diào)[1]；在代謝水平，表現(xiàn)為心肌能量底物由以脂肪酸β氧化為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐云咸烟墙徒鉃橹鳎@與過氧化物酶體增殖物 激 活 受體 α（peroxisome proliferator activated receptors α, PPARα）、 中 鏈 脂 酰 輔 酶 A 脫 氫 酶 (medium-chain acyl-CoA dehydrogenase, MCAD)、 肌型 肉堿棕櫚 酰轉(zhuǎn)移酶 -1(muscle carnitine palmitoyl transferase-1, MCPT-1) 活性降低密切相關(guān)[2,3]。研究發(fā)現(xiàn) PPARα 激活劑在壓力超負(fù)荷動(dòng)物模型早期短暫應(yīng)用即可減輕心肌肥厚[4]，但另有研究發(fā)現(xiàn)后期長期應(yīng)用反而加重心肌肥厚[5]。本研究將觀察 PPARα激活劑非諾貝特對(duì)壓力超負(fù)荷中期大鼠心肌重構(gòu)的影響，有助于探索其在心肌肥厚不同病理生理階段的作用機(jī)制。

1 材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：2010-07 至 2011-03，選擇 8 周齡健康雄性 Wistar大鼠 42 只（廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重 200～250 g。

分組、建立大鼠壓力超負(fù)荷模型及評(píng)價(jià) : 8 周齡健康 Wistar大鼠，參照文獻(xiàn) [6]采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立壓力超負(fù)荷模型后，隨機(jī)分為2組：對(duì)照組（14只）和非諾貝特組（14只）；另采用假手術(shù)（在腹主動(dòng)脈相同部位穿線但不結(jié)扎）建立假手術(shù)組（14 只）。術(shù)后抗感染4天，觀察4周后，各組分別取6只大鼠，麻醉固定后，經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入心導(dǎo)管，連接生理信號(hào)采集處理儀，記錄左心室收縮壓、左心室舒張末壓、左心室壓力上升和下降最大速率，評(píng)價(jià)模型建立情況。

壓力超負(fù)荷大鼠模型的干預(yù) : 模型成功建立后，非諾貝特組予非諾貝特 150 mg/（kg·d）溶于 2 ml生理鹽水后灌胃喂食；對(duì)照組、假手術(shù)組予等容積生理鹽水灌胃喂食。干預(yù)8周。

留取血清和心肌組織標(biāo)本 : 干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠留取血清；開胸取出心臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干水份后稱取左心室、右心室濕重，計(jì)算左心室濕重 /體重、右心室濕重 /體重，分別為左心室和右心室心肌質(zhì)量指數(shù)。心底部心肌組織分裝于4%甲醛液中固定，心尖部分于液氮中速凍后存于 -80℃超低溫冰箱，待分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

心肌組織病理學(xué)形態(tài) : 心肌組織按常規(guī)制作病理切片，做馬松（Masson）染色，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和膠原纖維分布，采用 HP IAS2000 計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析并計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)。

觀察心肌超微結(jié)構(gòu)及心肌線粒體損傷程度分級(jí)半定量分析 : 病理切片經(jīng)醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)尤其是線粒體的變化，并照片分析，按照 Flameng 評(píng)分[7]進(jìn)行損傷程度分級(jí)。

血清和心肌游離脂肪酸測定 : 按 Nixon 等[8]的方法，根據(jù)吸光率計(jì)算血清和心肌勻漿中游離脂肪酸的水平。

免疫印跡檢測PPARα、MCAD、MCPT-1蛋白表達(dá)。

半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測PPARα、MCAD、MCPT-1 基因 表達(dá) : 設(shè) 計(jì)并由 上海生 物 工程公 司合成 PPARα、MCAD、MCPT-1引 物，Trizol法 提 取 左 心 室 心 肌 組 織 總 核 糖 核 酸（RNA），取 2 μg RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成脫氧核糖核酸（cDNA），進(jìn)行 RT-PCR 后，取 PCR 產(chǎn)物 4 μl進(jìn)行凝膠電泳并經(jīng)成像系統(tǒng)分析，計(jì)算 PPARα、MCAD、MCPT-1 與甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶 (GAPDH)信使核糖核酸 （ mRNA）的灰度比值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 各組數(shù)據(jù)均采用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況

研究期間，假手術(shù)組死亡 2 只，對(duì)照組死亡 3 只，非諾貝特組死亡3只：死因多為感染、出血、呼吸衰竭和心力衰竭。最終，假手術(shù)組（12 只）、對(duì)照組（11 只）、非諾貝特組（11 只）到達(dá)研究終點(diǎn)。

2.2 壓力超負(fù)荷大鼠模型建立的評(píng)價(jià)

腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后4周測定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，對(duì)照組、非諾貝特組左心室收縮壓、左心室舒張末壓較假手術(shù)組增高（P＜0.05），左心室壓力上升和下降最大速率無明顯變化（P＞0.05）；對(duì)照組與非諾貝特組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。初步判斷壓力超負(fù)荷中期大鼠模型成功建立。

表1 3 組腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后 4 周血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（x±s, n=6）

2.3 3 組心肌重構(gòu)指數(shù)的變化

對(duì)照組及非諾貝特組左心室質(zhì)量指數(shù)較假手術(shù)組明顯增高；非諾貝特組與對(duì)照組比增高程度低于對(duì)照組（P均 ＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3 組間右心室質(zhì)量指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 3 組干預(yù)后心肌重構(gòu)指數(shù)變化（x±s）

2.4 3 組心肌形態(tài)及膠原纖維分布

心肌組織馬松染色顯示，對(duì)照組、非諾貝特組心肌粗大、間質(zhì)膠原纖維增生，進(jìn)一步計(jì)算膠原容積 分 數(shù)， 對(duì) 照 組、 非 諾 貝 特 組 分 別 為 3.14±0.37、2.47±0.55，較假手術(shù)組 1.78±0.42 均增高（P＜0.05），但非諾貝特組較對(duì)照組降低（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1

圖1 大鼠心肌的組織病理學(xué)比較。 A: 假手術(shù)組心肌細(xì)胞正常，排列整齊，無間質(zhì)膠原纖維增生；B: 對(duì)照組心肌稍顯粗大，排列尚整齊，間質(zhì)膠原纖維略顯增生；C: 非諾貝特組心肌纖維接近正常，排列整齊，間質(zhì)膠原纖維增生程度輕微。馬松染色

2.5 3 組心肌超微結(jié)構(gòu)及線粒體損傷程度分級(jí)半定量分析

電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)，對(duì)照組、非諾貝特組心肌細(xì)胞及線粒體腫脹、破壞，非諾貝特組輕于對(duì)照組（圖2）；作線粒體損傷程度 Flameng 評(píng)分，對(duì)照組、非諾貝特組心肌線粒體損傷程度分別 為 1.7±0.5、1.0±0.4，均高 于假 手術(shù) 組 0.4±0.3（P＜0.05），非諾貝特組則低于對(duì)照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 大鼠心肌的超微結(jié)構(gòu)圖。A: 假手術(shù)組心肌細(xì)胞無腫脹，胞膜完整，肌絲整齊，肌小節(jié)明、暗帶清晰，線粒體整齊，膜完整，無腫脹，嵴突規(guī)則致密，線粒體間可見黑色糖原顆粒；B: 對(duì)照組心肌細(xì)胞腫脹，間有肌節(jié)溶解，伴肌膜破損，肌絲紊亂，線粒體明顯腫脹，基質(zhì)透明，嵴斷裂或消失；C: 非諾貝特組心肌細(xì)胞輕度腫脹，肌絲基本整齊，肌節(jié)基本完整，線粒體輕度腫脹，基質(zhì)基本完整，基質(zhì)顆粒部分消失，嵴較規(guī)則，少部分?jǐn)嗔?/p>

2.6 3 組血清及心肌游離脂肪酸的變化

對(duì) 照 組 血 清 游 離 脂 肪 酸（440.7±77.3）μmol/L高 于 假 手 術(shù) 組（325.8±62.5）μmol/L 和 非 諾 貝 特組（256.6±48.8）μmol/L；對(duì)照組心肌游離脂肪酸（336.0±42.5）μmol/L 高 于 假 手 術(shù) 組（187.5±44.7）μmol/L 和 非 諾 貝 特 組（192.4±46.5）μmol/L（P 均＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 3 組心肌 PPARα、MCAD、MCPT-1 蛋白表達(dá)的變化

對(duì)照組、非諾貝特組心肌PPARα、MCAD、MCPT-1蛋白表達(dá)較假手術(shù)組均明顯下調(diào)；非諾貝特組較對(duì)照組均顯著上調(diào)（P均 ＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠心肌 PPARα、MCPT-1、MCAD 蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較*P＜0.05；與對(duì)照組比較△P＜0.05。GAPDH：甘油醛 -3-磷酸脫氫酶 PPARα：過氧化物酶體增殖物激活受體 α MCAD：中鏈脂酰輔酶 A 脫氫酶 MCPT-1：肌型肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 -1。Sh：假手術(shù)組；C：對(duì)照組；F：非諾貝特組

2.8 3 組 心 肌 PPARα、MCAD、MCPT-1 mRNA 基因表達(dá)的變化

對(duì)照組、非 諾 貝特組 心 肌 PPARα、MCAD、MCPT-1 mRNA 基因 表達(dá) 均較 假手術(shù)組明 顯下 調(diào)（P＜0.05）；非諾貝特組均較對(duì)照組顯著上調(diào)（P 均＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4

圖4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測各組大鼠心肌 PPARα、MCAD、MCPT-1 mRNA表達(dá)。余注見圖3

3 討論

壓力超負(fù)荷下，心肌在結(jié)構(gòu)水平、代謝水平、基因表達(dá)水平均產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)，以維持正常的心臟功能[9-11]。腹主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的壓力超負(fù)荷大鼠，心肌肥厚多始于術(shù)后 4 周[12]，而心肌代謝模式轉(zhuǎn)換則始于術(shù)后 8 周[5]?；诂F(xiàn)有的研究，PPARα 激活劑在壓力超負(fù)荷早期（2～4 周）短暫干預(yù)減輕心肌肥厚，后期（8～12 周 ）長期干預(yù)可能加重心肌肥厚[5，12]。本研究 旨在觀察 PPARα 激活劑非 諾貝特在壓力超負(fù)荷中期對(duì)大鼠心肌肥厚的影響。選擇術(shù)后4周開始干預(yù)，持續(xù)到術(shù)后12周，覆蓋心肌重構(gòu)和代謝重構(gòu)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期，預(yù)期研究結(jié)果相對(duì)具有代表性。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4周，模型組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)明顯變化，提示進(jìn)入壓力超負(fù)荷中期；術(shù)后 12周，壓力后負(fù)荷的增加，左心室心肌為了維持正常的心臟輸出，發(fā)生了心肌肥厚；馬松染色證實(shí)，心肌正經(jīng)歷由代償性肥厚向失代償性肥大和纖維化演變的進(jìn)程。采用 PPARα 激活劑非諾貝特干預(yù)，可延緩壓力超負(fù)荷中期大鼠心肌肥厚的演變進(jìn)程。

壓力超負(fù)荷下心肌代謝已經(jīng)發(fā)生“能量缺乏”， 而心肌結(jié)構(gòu)則逐漸出現(xiàn)“失調(diào)”，表現(xiàn)為心肌脂肪酸代謝水平和相關(guān)基因表達(dá)已下調(diào)，出現(xiàn)心肌肥厚和輕度纖維化，但光鏡下心肌結(jié)構(gòu)完整，排列整齊[13]。為了避免持續(xù)的代謝“能量缺乏”進(jìn)一步導(dǎo)致結(jié)構(gòu)“失調(diào)”，提高心肌能量代謝水平尤為重要。本研究證實(shí)，模型組血清和心肌游離脂肪酸增高，可能是心肌脂肪酸β氧化轉(zhuǎn)變?yōu)橐云咸烟墙徒鉃橹鞯拇x模式，脂肪酸攝取減少，氧化能力減弱，導(dǎo)致脂肪酸蓄積，并產(chǎn)生自由基損傷線粒體、呼吸鏈和亞細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)相關(guān)酶的功能，抑制線粒體、肌漿網(wǎng)和胞質(zhì)酶體系中 Ca2+- 三磷酸腺苷（ATP）酶和 Na+-K+-ATP 酶等的活性[14，15]，最終將抑制糖酵解模式的效率，導(dǎo)致心肌細(xì)胞和線粒體損傷逐漸加重，心肌能量進(jìn)一步匱乏。

近年研究發(fā)現(xiàn)，PPARα可調(diào)控其下游編碼基因MCAD、MCPT-1。MCPT-1 是脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體的關(guān)鍵酶，MCAD則是線粒體脂肪酸氧化第一步的關(guān)鍵酶。PPARα 激活劑可通過上調(diào) PPARα 及其所調(diào)控的MCAD、MCPT-1基因表達(dá)，增強(qiáng)脂肪酸氧化，提高心肌能量代謝水平[16，17]。本研究中，心肌 PPARα、MCAD、MCPT-1蛋白和基因的表達(dá)在對(duì)照組均下調(diào)，在非諾貝特組則上調(diào)，提示非諾貝特可能通過上調(diào)脂肪酸氧化相關(guān)酶表達(dá)，改善代謝水平來減輕心肌肥厚。但另有研究表明長期激活可使脂肪酸過度氧化，增加心肌耗氧量，降低氧化效率，加劇心肌能量匱乏，加重心室重構(gòu)。提示在機(jī)體能量代謝演變的不同階段，脂肪酸氧化與葡萄糖酵解模式之間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換，可能存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。總之，在壓力超負(fù)荷中期，PPARα 激活劑非諾貝特能夠改善心肌能量代謝，延緩心室重構(gòu)，其機(jī)制可能與上調(diào)心肌 PPARα、MCAD、MCPT-1 蛋白和基因的表達(dá)增加脂肪酸氧化有關(guān)。

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Effect of Fenofibrate on Myocardial Energy Metabolism and Ventricular Remodeling in Metaphase Pressure Overloaded Rats

HE Yan, WU Jiang-tao, ZHONG Guo-qiang, WU Long-fei, LI Xing-san, WANG Yan, CHEN Zhuo-hong, Bi Qi.
Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,
Nanning (530021), Guangxi, China

Objective: To investigate the effect of fenofibrate on myocardial energy metabolism and ventricular remodeling in metaphase pressure overloaded rats.Methods: The metaphase pressure overloaded animal model was established by aortic constriction in wistar rats and then randomly divided them into 3 groups, Control group and Sham operation (Sham) groupand the rats received normal saline in both groups, and Medication group, the rats received fenofibrate 150mg/(kg·d). n=14 in each group, all animals were treated for 8 weeks. The rats’ myocardial structure was observed by light microscope and the collagen volume fraction was calculated. The mitochondrial structure was studied by electron microscope and the Flameng score for myocardial mitochondrial injury was calculated. Serum and myocardial free fatty acid levels were examined, PPARα, MCAD and MCPT-1 gene and protein expressions were assessed by RT-PCR and western blot analysis respectively.Result: ① Compared with Sham group, both Control and Medication groups presented increased left ventricular weight index and collagen volume fraction; Medication group was much lower than that in Control group, P＜0.05. ② Compared with Sham group, both Control and Medication groups showed increased Flameng score; Medication group was lower than that in Control group, P＜0.05. ③ The serum and cardiac free fatty acid level in Medication group was lower than Control group, P＜0.05. ④ The expression of PPARα, MCPT-1 and MCAD in both Control and Medication groups were down-regulated than that in Sham group; they were up-regulated in Medication group than that in Control group, P＜0.05.Conclusion: Fenofibrate could increase fatty acid oxidation through up-regulating the expression of PPARα, MCPT-1 and MCAD, and therefore, reducing the serum and cardiac free fatty acid levels, extenuate mitochondrial injury, those are helpful to protect the cardiac function in metaphase of pressure overload rats.

Fenofibrate; Hypertrophy; Remodeling; Energy metabolism; Pressure overload

HE Yan, E-mail:hyxjwxy@126.com

2012-05-19)

（編輯：漆利萍）

*

廣西壯族自治區(qū)科技廳青年基金項(xiàng)目資助（桂科青 0728064），本研究受“廣西大型儀器協(xié)作共用網(wǎng)資助 ” 項(xiàng)目編號(hào)：635-2008-048

530021 廣西壯族自治區(qū)南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 老年心內(nèi)科

何燕 主任醫(yī)師 博士 主要研究方向?yàn)槁孕牧λソ邫C(jī)制及臨床 Email：hyxjwxy@126.com 通訊作者：何燕

R541

A

1000-3614（2013）02-0140-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.02.018

方法 :采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立 Wistar 大鼠壓力超負(fù)荷模型，隨機(jī)分為對(duì)照組（14 只 ）和非諾貝特組（14 只）；另建立假手術(shù)組（14 只 ）。假手術(shù)組和對(duì)照組給予生理鹽水、非諾貝特組給予非諾貝特 150 mg/(kg·d)，干預(yù) 8 周后，留取大鼠心肌，光鏡觀察心肌結(jié)構(gòu)，計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)；電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)，進(jìn)行 Flameng 評(píng)分；測定血清及心肌游離脂肪酸水平；蛋白質(zhì)印跡法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測過氧化物酶體增殖物激活受體 α（PPARα）、中鏈脂酰輔酶 A 脫氫酶 (MCAD)、肌型肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 -1(MCPT-1)蛋白及基因表達(dá)。

結(jié)果:①干預(yù)后，對(duì)照組、非諾貝特組心肌左心室質(zhì)量指數(shù)、膠原容積分?jǐn)?shù)較假手術(shù)組增高，非諾貝特 組則較對(duì)照組明顯降低（P 均 ＜0.05）；②干預(yù)后，對(duì)照組、非諾貝特組心肌線粒體損傷 Flameng 評(píng)分高于假手術(shù)組，非諾貝特組評(píng)分低于對(duì)照組（P 均 ＜0.05）；③干預(yù)后，非諾貝特組血清及心肌游離脂肪酸較對(duì)照組明顯降低（P均 ＜0.05）；④干預(yù)后對(duì)照組、非諾貝特組心肌 PPARα、MCPT-1、MCAD 蛋白及基因表達(dá)均較假手術(shù)組下調(diào)， 非諾貝特組較對(duì)照組上調(diào)（P均 ＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論 :在壓力超負(fù)荷中期，非諾貝特通過上調(diào)大鼠心肌 PPARα、MCPT-1、MCAD 基因表達(dá)，增強(qiáng)脂肪酸氧化，而降低血清和心肌游離脂肪酸，減輕線粒體損傷，減輕左心室肥厚和心肌纖維化，有助于保護(hù)壓力超負(fù)荷下大鼠心臟功能。