頭頸部鱗癌中ALDH1、α-SMA的表達(dá)及其意義

陳超 魏燕 葛明華

頭頸部鱗癌中ALDH1、α-SMA的表達(dá)及其意義

陳超 魏燕 葛明華

目的研究頭頸部鱗癌（HNSCC）中ALDH1和α-SMA的表達(dá)情況及其與腫瘤轉(zhuǎn)移和分期的關(guān)系。方法通過免疫組化雙染在60例HNSCC標(biāo)本上對(duì)ALDH1和α-SMA的表達(dá)水平和分布情況進(jìn)行研究，同時(shí)利用Real-time PCR對(duì)其mRNA表達(dá)情況進(jìn)行半定量分析比較，結(jié)合病例臨床病理資料研究加以分析。結(jié)果ALDH1在HNSCC中有不同程度的表達(dá)，其表達(dá)水平與頭頸腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間關(guān)系緊密，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；α-SMA陽性的細(xì)胞主要分布與腫瘤-正常組織交界處，其表達(dá)強(qiáng)弱與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否密切相關(guān)，α-SMA在分化差的病例中表達(dá)有增高趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ALDH1和α-SMA的表達(dá)在有轉(zhuǎn)移的腫瘤中具有高度協(xié)同性。結(jié)論ALDH1和α-SMA可分別或相互組合作為判斷HNSCC有無轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

頭頸部鱗癌 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 乙醛脫氫酶1

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the expression of ALDH1 and α-SMA in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)and its clinicopathological significance．MethodsThe clinical and pathological data of 60 cases of HNSCC were collected．The expression of ALDH1 and α-SMA proteins was examined by immunohistochemical double staining on paraffin sections;and the ALDH1 and α-SMA mRNA levels were determined by semi-quantitative real-time PCR．ResultsThe expression of ALDH1 was closely correlated with tumor stage and lymph node metastasis in HNSCC．The α-SMA positive cells were mainly located at the invading border of tumor and its expression level was closely correlated with lymph node metastasis．There was a tendency of increased α-SMA positive cells in poorly-differentiated cancers;however,there was no statistical difference．ALDH1 and α-SMA expression showed a high coincidence in tumors with positive lymph nodes．ConclusionsALDH1 and/or α-SMA might be good indicators for prediction of lymph node metastasis in HNSCC．

新近研究發(fā)現(xiàn)腫瘤間質(zhì)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。我們的前期研究[1]中發(fā)現(xiàn)在頭頸部鱗癌（HNSCC）中，肌纖維母細(xì)胞在體外可由上皮性腫瘤細(xì)胞經(jīng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）轉(zhuǎn)變而來，同時(shí)高表達(dá)α-SMA和ALDH1。本文對(duì)ALDH1和α-SMA在HNSCC中的表達(dá)分布與腫瘤轉(zhuǎn)移、分期及預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行分析，以探討其臨床價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 從浙江省腫瘤醫(yī)院標(biāo)本庫中選取60例HNSCC石蠟標(biāo)本，時(shí)間跨度為2005至2010年，所有病例均有明確的病理診斷，男44例，女16例，年齡34～72歲。按有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組（N+）36例，無轉(zhuǎn)移組（N0）24例，其中口腔癌22例、口咽癌18例、下咽癌20例；根據(jù)組織學(xué)情況分為高、中、低分化組，具體pTNM分期情況見表1。

表1 60例HNSCC病理及pTNM分期

1.2 方法

1.2.1 免疫組化雙染 標(biāo)本石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、逐級(jí)水化，抗原修復(fù)采用Epitope Retrieval solution（DAKO），95～100℃,20 min。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，抗原封閉。加入anti-ALDH1一抗（1∶400，美國BD公司產(chǎn)品）室溫孵育1h，充分沖洗后加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min，利用streptavidin-AP試劑盒進(jìn)行顯色。沖洗后加入小鼠血清，孵育5min封閉多余二抗，加入anti-α smooth muscle actin（α-SMA，1∶50）室溫孵育30min，沖洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，繼續(xù)孵育30 min，加入DAB進(jìn)行顯色，蘇木素染色顯示細(xì)胞核，沖洗后封片，顯微鏡下觀察。依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法，綜合考慮切片中陽性細(xì)胞所占觀察細(xì)胞數(shù)的百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo)，半定量判定結(jié)果。根據(jù)著色強(qiáng)度判斷陽性程度：標(biāo)本無色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占觀察細(xì)胞數(shù)的百分比，隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡典型視野（×400）約200個(gè)細(xì)胞。陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩項(xiàng)指標(biāo)的乘積即為最終的總積分，按其將結(jié)果分為4級(jí)：0～3為（-），4～5為（+），6～7為（++），8分以上為（+++），將前兩者歸為低表達(dá)，后兩者為高表達(dá)。

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè) 采用RNeasy kit（德國Qiagen公司產(chǎn)品）從石蠟切片中提取總RNA，采用隨機(jī)引物法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，所有cDNA儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆?。qRTPCRs試劑盒采用Power SYBR Green mix（美國ABI公司產(chǎn)品），熒光定量PCR儀為Chromo 4（德國BioRad公司產(chǎn)品），反應(yīng)以GAPDH為內(nèi)參基因，所有樣本均設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不加模版的孔作為陰性對(duì)照。數(shù)據(jù)分析采用改良delta delta Ct法，引物序列見表2。反應(yīng)條件如下：95℃10min激活DNA聚合酶，94℃15s，56℃，30s，72℃，40s共40個(gè)循環(huán)。

表2 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)所用引物

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用卡方檢驗(yàn)比較HNSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組之間ALDH1、α-SMA的表達(dá)差異；采用Spearman相關(guān)分析比較ALDH1、α-SMA表達(dá)水平與病理分期間的相關(guān)性；Real-time PCR數(shù)據(jù)分別以無轉(zhuǎn)移病例和轉(zhuǎn)移病例原發(fā)灶靶基因mRNA表達(dá)水平為參照，采用改良delta delta Ct法比較mRNA表達(dá)水平，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

2.1.1 α-SMA、ALDH1在HNSCC中的表達(dá)及分布 α-SMA在HNSCC中的表達(dá)水平變化較大，其表達(dá)陽性細(xì)胞主要位于腫瘤浸潤的前緣，即腫瘤-正常組織交界處,胞質(zhì)呈棕黃色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)背景清晰的纖細(xì)、長梭形棕黃及棕褐色顆粒，部分間質(zhì)小血管亦可表達(dá)α-SMA，但不被計(jì)為陽性細(xì)胞。ALDH1在大多數(shù)HNSCC中均有不同程度的表達(dá)，其表達(dá)部位主要位于腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)，少數(shù)淋巴細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞也可有低水平的表達(dá)。在有轉(zhuǎn)移的HNSCC原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)以及病理為低分化的HNSCC中ALDH1、α-SMA陽性細(xì)胞較無轉(zhuǎn)移者及高分化者明顯增多，著色更深（圖1，表3）。

圖1 頭頸部鱗癌（HNSCC）中ALDH1、α-SMA免疫組化雙染結(jié)果[注:有轉(zhuǎn)移的HNSCC原發(fā)灶中（A-2）ALDH1（紅色）及α-SMA（棕色）的表達(dá)水平高于無轉(zhuǎn)移病例（A-1）,α-SMA陽性細(xì)胞主要位于腫瘤-正常組織交界處；轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中（B-2）ALDH1及α-SMA的表達(dá)水平高于其原發(fā)灶（B-1）；低分化HNSCC中（C-2）ALDH1及α-SMA的表達(dá)水平高于高分化者（C-1）]

表3 ALDH1和α-SMA的免疫組化結(jié)果

2.1.2 α-SMA、ALDH1表達(dá)水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 見表4。

表4 ALDH1、α-SMA與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系（例）

由表4可見，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HNSCC中ALDH1、α-SMA的表達(dá)水平較無轉(zhuǎn)移者顯著增高，其中26例患者（26/36）同時(shí)高表達(dá)ALDH1和α-SMA（即ALDH1hingh、α-SMAhigh），顯著高于無轉(zhuǎn)移的患者（3/24），與之相對(duì)應(yīng)的同時(shí)低表達(dá)ALDH1和α-SMA（即ALDH1low α-SMAlow）的患者比例在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（6/ 36）則明顯低于無轉(zhuǎn)移組（11/24，P＜0.01），說明ALDH1和α-SMA的高表達(dá)與HNSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

2.1.3 α-SMA、ALDH1表達(dá)水平與腫瘤病理分期的關(guān)系 見表5。

表5 ALDH1、α-SMA與腫瘤病理分期的關(guān)系（例）

由表5可見，高表達(dá)ALDH1的患者比例在高分化HNSCC中偏低（7/24），隨著分化程度的降低其比例逐漸升高，在低分化的HNSCC中達(dá)到最高（14/16），其Spearman相關(guān)系數(shù)為0.562（P＜0.01）；α-SMA的表達(dá)情況與ALDH1類似，隨著分化程度的降低其高表達(dá)比例逐漸升高，在低分化的HNSCC中表達(dá)最多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在低分化HNSCC中，α-SMA和ALDH1的表達(dá)具有高度協(xié)同性，高表達(dá)α-SMA的14例患者均同時(shí)高表達(dá)ALDH1，Spearman相關(guān)系數(shù)為0.596（P＜0.001），說明ALDH1和α-SMA表達(dá)與腫瘤病理分期之間存在正相關(guān)性。

2.2 Real-time PCR 熒光定量PCR結(jié)果顯示在有轉(zhuǎn)移的HNSCC患者中ALDH1和α-SMA的mNRA水平較無轉(zhuǎn)移的患者平均分別升高了6.4倍和6.5倍；同時(shí)在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中，ALDH1和α-SMA的mNRA水平較同一患者原發(fā)病灶平均分別升高了2.7倍和3.8倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 Real-time PCR半定量分析HNSCC中ALDH1、α-SMA mRNA表達(dá)水平[注：A：有轉(zhuǎn)移的HNSCC中ALDH1和α-SMA mNRA平均是無轉(zhuǎn)移HNSCC的6.4倍和6.5倍（P＜0.01）；B：在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中ALDH1和α-SMA mNRA平均是其原發(fā)灶的2.7倍和3.8倍（P＜0.01）]

3 討論

自1971年Gabbiani和Majno通過電子顯微鏡對(duì)肉芽組織的觀察，首先提出了肌纖維母細(xì)胞以來，肌纖維母細(xì)胞就一直是一個(gè)充滿爭議的問題[2-3]。目前認(rèn)為肌纖維母細(xì)胞是一群同時(shí)具有平滑肌和纖維母細(xì)胞特征的細(xì)胞。腫瘤間質(zhì)中的肌纖維母細(xì)胞主要來源于活化的具有平滑肌表型的纖維母細(xì)胞，故又稱為癌/腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞（cancer associated fibroblast，CAF），該細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤的過程有著密切的關(guān)系。肌纖維母細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志是表達(dá)特征性的α-SMA及一些平滑肌的標(biāo)志如desmin、平滑肌肌球蛋白重鏈[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)肌纖維母細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤的生長及腫瘤新生血管形成，并且能夠促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移[5]。Horie等[6]在對(duì)肺癌進(jìn)行研究中發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中CAFs與正常成纖維細(xì)胞相比有一個(gè)顯著的特點(diǎn)即高表達(dá)α-SMA，在體外將CAFs與肺癌細(xì)胞株共同培養(yǎng)，可顯著增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲能力。同樣，在前列腺癌中，α-SMA陽性的肌纖維母細(xì)胞增多與腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。人為的抑制肌纖維母細(xì)胞的產(chǎn)生和分化可抑制腫瘤的生長[7]。本研究通過對(duì)60例HNSCC患者組織標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤間質(zhì)中肌纖維母細(xì)胞數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否密切相關(guān)（P＜0.05），在有轉(zhuǎn)移的腫瘤中α-SMA的表達(dá)水平顯著高于無轉(zhuǎn)移組，且轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中α-SMA的表達(dá)也顯著高于原發(fā)灶。此類表達(dá)α-SMA的細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞的外觀，多位于腫瘤浸潤的前緣（即腫瘤-正常組織交界處），研究結(jié)果與陳珊珊等[8]在乳腺癌中的研究結(jié)論一致。

ALDH1是目前較為公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，已在包括HNSCC在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中得到證實(shí)[9-13]，ALDH1+的腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療抵抗的主要原因之一。我們?cè)诖饲暗难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)[1]，HNSCC細(xì)胞系中ALDH1+的腫瘤干細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力，通過懸浮培養(yǎng)法可誘導(dǎo)HNSCC細(xì)胞發(fā)生不同程度的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（Epithelial-Mesenchymal transition，EMT），發(fā)生EMT的HNSCC細(xì)胞高表達(dá)ALDH1，同時(shí)具有間質(zhì)細(xì)胞的某些特性，更值得注意的是此類細(xì)胞同時(shí)高表達(dá)α-SMA，說明α-SMA與ALDH1的表達(dá)在HNSCC中可能存在某種關(guān)聯(lián)。本文通過對(duì)組織蠟塊染色及Real-time PCR發(fā)現(xiàn)，在HNSCC中α-SMA、ALDH1的表達(dá)存在高度一致性：在有轉(zhuǎn)移的患者中兩者的表達(dá)無論在蛋白水平還是mRNA水平均一致性增高，同樣隨著病理分級(jí)的增高，同時(shí)高表達(dá)α-SMA和ALDH1的比例也隨之上升，各分級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中ALDH1的表達(dá)水平顯示出與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間關(guān)系緊密；α-SMA的表達(dá)強(qiáng)弱則與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否密切相關(guān)，雖然α-SMA在分化差的病例中表達(dá)也增高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究樣本量偏小有關(guān)，具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究證明。值得注意的是在無轉(zhuǎn)移組中分別有5例ALDH1high和11例α-SMAhigh的病例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而同時(shí)高表達(dá)α-SMA和ALDH1的僅有3例，因此，α-SMA與ALDH1單獨(dú)或者組合用于檢測(cè)HNSCC，將有助于預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性，為該類患者的治療提供幫助。

總之，HNSCC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程.與腫瘤細(xì)胞的干性、間質(zhì)的狀態(tài)及轉(zhuǎn)移局部組織的特性等有密切的關(guān)系。本研究表明，聯(lián)合檢測(cè) α-SMA、和ALDH1有助于判斷疾病的惡性程度、浸潤能力及轉(zhuǎn)移潛能，可作為預(yù)測(cè)HNSCC預(yù)后的新指標(biāo)。

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Expression of ALDH1 and α-SMA in head and neck squamous cell carcinoma and its clinicopathological significance

HNSCC α-SMA ALDH1

2012-12-28）

（本文編輯：田云鵬）

310022 杭州，浙江省腫瘤醫(yī)院頭頸外科（陳超、葛明華）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（魏燕）

陳超，E-mail：lancet2000@msn.com