microRNA在心血管疾病中的作用及其法醫(yī)學意義

（復旦大學上海醫(yī)學院法醫(yī)學系，上海 200032）

microRNA（miRNA或miR）是一類21～25nt大小的單鏈非編碼RNA，通過與mRNA的3′端非編碼序列互補結合而導致mRNA降解或抑制蛋白質翻譯過程，在轉錄后水平調節(jié)基因表達，調節(jié)人類約三分之一的蛋白表達，從而調節(jié)生物體的生長發(fā)育、細胞增殖與凋亡、疾病的發(fā)生與發(fā)展等[1]。近年來與心血管疾病相關的miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，本文擬從心臟組織和循環(huán)血液中的miRNA兩方面概述與心血管疾病相關的miRNA的研究現(xiàn)狀，并探討miRNA在心源性猝死法醫(yī)學鑒定中的可能應用。

1 miRNA的生物學特性

miRNA首次由Lee等[2]于1993年在線蟲中發(fā)現(xiàn)，隨后相關于miRNA的研究越來越多，目前發(fā)現(xiàn)miRNA既可在細胞內存在，也可在細胞外的循環(huán)體液中存在[3-4]。細胞內miRNA通常由pri-miRNA途徑合成：非編碼序列的基因轉錄形成pri-miRNA，pri-miRNA在Drosha酶的剪切下變?yōu)?0 nt左右的莖環(huán)狀發(fā)夾結構即pre-miRNA，此為miRNA的前體，但還不成熟，然后pre-miRNA經核膜上的Exportin5轉運入胞漿，在胞漿內由Dicer酶切除莖環(huán)的環(huán)部結構，形成21～25nt的雙鏈結構，即 miRNA/miRNA*（miRNA* 為miRNA的互補鏈）。該雙鏈結構中的miRNA再被高親和地選擇，與Dicer酶、Ago蛋白等組裝為miRNA誘導的基因沉默復合物（miRISC），miRNA*則被降解[5]。最近胞內miRNA的mirtron合成途徑在哺乳動物、果蠅和線蟲中被發(fā)現(xiàn)[6-8]，證實了miRNA還可由mirtron途徑合成，即內含子轉錄形成的非成熟mRNA部分經剪接子剪接作用（區(qū)別于Drosha酶作用）形成了pre-mirtron，而后pre-mirtron經Exportin5轉運入胞漿，與pri-miRNA途徑類似，由Dicer酶剪切，最終形成miRISC[5]。

目前循環(huán)血液中的miRNA被廣泛檢測及篩選。循環(huán)miRNA可能系體細胞在負荷、損傷等刺激下由胞內分泌至胞外。循環(huán)miRNA能在循環(huán)中逃避RNA的降解從而穩(wěn)定存在[9]，其機制可能是miRNA通過外體[10]、超微小泡[11]、凋亡小體[12]或者形成蛋白質-RNA復合物[13]來實現(xiàn)?；诖?，循環(huán)miRNA的主要優(yōu)點有：（1）穩(wěn)定，不受環(huán)境影響；（2）有組織特異性；（3）易通過RT-PCR定量檢測。因此，循環(huán)miRNA具有成為心血管疾病生物學標志的巨大潛能，可能為疾病診斷及預后提供參考。

2 miRNA與心血管疾病

未成熟的miRNA沒有生物學功能，需要在Dicer酶的作用下完成加工成熟過程。Zhao等[14]利用Chelex技術特異性地敲除胚胎小鼠心肌組織中的Dicer酶基因，結果導致小鼠胚胎出現(xiàn)心包膜水腫、心室心肌層停止發(fā)育等多種發(fā)育問題，胚胎很快發(fā)生心力衰竭而死亡，表明miRNA與心血管疾病有密切關系。

2.1 miRNA與心肌肥大、心力衰竭

心肌肥大、心力衰竭所涉及的miRNA主要有miRNA-1、miRNA-133、miRNA-208 以 及 miRNA-195，而 miRNA-21、miRNA-34a、miRNA-150 等也有報道。其中抑制心肌肥大的有miRNA-1、miRNA-133、miRNA-150等，促進心肌肥大的有miRNA-208、miRNA-195、miRNA-21、miRNA-34a 等。

Cheng等[15]研究表明，在病理性心肌肥大中miRNA-1、miRNA-133表達下調，提示可能是心肌肥大的普遍通路，并提出了miRNA-1可能的靶基因：Ras-GAP、Cdk9、Rheb 及纖維連接素（fibronectin）。 Carè等[16]研究認為，miRNA-133的靶基因為Rho-A、Cdc42以及Nelf-A/WHSC2。miRNA-1及miRNA-133的下調減少了對靶基因的抑制表達，從而引起心肌肥大。

miRNA-208是由α肌球蛋白重鏈（α-myosin heavy chain，α-MHC）基因的27位內含子編碼產生，能在應激時上調β-MHC的表達，抑制纖維化。Satoh等[17]比較了82例擴張型心肌病和21例正常人的miRNA-208、miRNA-208a以及 miRNA-499后，發(fā)現(xiàn)miRNA-208與β-MHC的相關性很好，與擴張型心肌病的關聯(lián)性大。van Rooij等[18]則不僅證實miRNA-208與心肌肥大相關，還首次提出甲狀腺相關的蛋白質激素受體（THRAP1）是miRNA-208的作用靶點。該實驗還在大鼠胸主動脈狹窄心肌肥大模型中篩選了一系列表達上調的miRNA，并通過轉基因的方法過表達miRNA-195，發(fā)現(xiàn)miRNA-195足以引起心肌肥大和心力衰竭。不同的研究得出了不同的結論，提示miRNA與心肌肥大、心力衰竭存在關聯(lián)性。

2008年，Chen等[19]對中國人血清中所有miRNA進行測序分析，提出血清miRNA是一種能夠應用于檢測多種癌癥和其他疾病的潛在生物學指標。Tijsen等[20]篩選并檢測了12位慢性心衰（chronic heart failure，CHF）患者和 12位正常人的血液miRNA，發(fā)現(xiàn)miRNA-423-5p在CHF中升高最明顯，并且與急性心肌梗死關系密切的miRNA-1、miRNA-208在CHF中并不升高，提示miRNA-423-5p在CHF中特異性較好。此外，Corsten等[21]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-499在急性心衰（acute heart failure，AHF）患者血液中升高明顯，而且肝特異性的miRNA-122也升高，推測為心力衰竭后肝靜脈淤血所致。提示miRNA-499與AHF可能有關系。可見AHF、CHF中可能分別和血液中某種miRNA存在密切關聯(lián)性。

2.2 miRNA與急性冠脈綜合征

Bostjancic等[22]研究了24例急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者，發(fā)現(xiàn)心臟梗死區(qū)的遠端心肌miRNA-1高表達，此外Shi等[23]在小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)不同的miRNA在心梗后隨時間不同表達也各異。如心梗后第2天，miRNA-31、miRNA-223、miRNA-18a以及miRNA-18b表達上調，而第7天miRNA-31、miRNA-214、miRNA-199a-5p 以及 miRNA-199a-3p上調，提示某些miRNA可作為心梗后特定時間的特異性生物學指標，同時也表明不同的miRNA與心梗后心肌后續(xù)損傷相關。Fazi等[24]和Sluijter等[25]研究分別發(fā)現(xiàn)miRNA-233、miRNA-499與炎癥相關，而Shi等[23]研究表明心梗后早期miRNA-233、miRNA-499表達改變，說明心梗后早期以組織炎癥損傷為主。

血液循環(huán)中的miRNA與急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）的關系一直是研究熱點。Ji等[26]發(fā)現(xiàn)大鼠血漿miRNA-208可以作為心肌損傷的重要標志，不僅與cTnI線性關系很好，而且在其他部位表達量并不升高，提示miRNA-208具有很好的組織特異性。但Adachi等[27]在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)miRNA-208并不具有心肌特異性，而miRNA-499在AMI患者中呈特異性表達。Corsten等[21]在研究32位AMI時發(fā)現(xiàn)miRNA-208b和miRNA-499顯著升高，和對照組相比分別升高1600倍和100倍。這些均提示miRNA-208a、miRNA-208b或miRNA-499可能作為人類AMI的生物學指標。Wang等[28]發(fā)現(xiàn)所有心梗患者在發(fā)作4 h內miRNA-208a都能檢測到（cTnI不能檢測出陽性變化），支持miRNA-208a可作為心梗早期診斷指標的觀點，Widera等[29]發(fā)現(xiàn)miRNA-133a或miRNA-208b可單獨用于ACS的預后診斷。

2.3 miRNA與急性肺動脈栓塞

急性肺動脈栓塞（acute pulmonary embolism，APE）發(fā)病急、死亡率高，而目前診斷主要依賴于D-二聚體的檢測和胸部CT平掃。D-二聚體檢測缺乏特異性，螺旋CT動脈造影特異性雖然能達90%，但檢查費用昂貴，且造影劑可能導致過敏、腎衰等副反應，因此尋找一種特異性高又適合推廣的生物學指標很有必要。Xiao等[30]選取了32例APE病例、32位正常人以及22位非APE患者的血漿進行篩選，結果發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-134僅在APE患者血漿中高表達，特異性非常高，因此可能是APE的有效生物學指標。

2.4 miRNA與心律失常

Yang等[31]研究發(fā)現(xiàn)正常小鼠注射miRNA-1后出現(xiàn)心律失常，注射miRNA-1阻斷劑后心律失常發(fā)生率明顯降低，提示miRNA-1與心律失常關系密切，進一步研究顯示miRNA-1作用的靶基因分別為KCN2和GJA1。其中KCN2為編碼細胞膜K+通道蛋白主要亞基，GJA1編碼心肌縫隙連接蛋白43（connexin 43，CX43），因此 miRNA-1 通過抑制 K+通道蛋白和CX43的基因表達，從而干擾靜息膜電位并阻止心肌細胞間信號傳遞，最終導致心律失常，這與Bostjancic 等[22]的研究結果一致。此外，Bostjancic 等[22]發(fā)現(xiàn)心律失常的樣本中miRNA-133表達下調，這與Luo等[32]研究發(fā)現(xiàn)的miRNA-133抑制起搏點通道基因HCN2表達結論一致。miRNA-133下調，則HCN2表達上升，因而導致心律失常。由此可見，miRNA-1表達上調，miRNA-133表達下調可能分別導致靶基因的表達異常，從而導致心律失常，這為心律失常的診斷和治療提供了新的思路。

3 miRNA的法醫(yī)學意義

miRNA在生物體內廣泛存在，大量研究報道了miRNA對心血管疾病的作用，包括心肌肥大、心力衰竭、急性心肌梗死、急性肺動脈栓塞、心律失常等。心肌組織中一種或幾種miRNA表達改變可能為某種心血管疾病的特異性指標，因此有望為心源性猝死的死因分析提供新思路。如miRNA-1表達上調被認為是心梗后誘發(fā)心肌重構和心律失常的重要因子[31，33]，猝死者檢測到miRNA-1表達上調則提示死因為心梗后誘發(fā)的心律失常。miRNA主要由細胞內mirtron途徑和經典pri-miRNA途徑產生，當物理、化學等因素導致細胞受損時，miRNA也會從胞內進入胞外的體循環(huán)中。循環(huán)血液中的miRNA能通過多種機制逃避循環(huán)中RNA酶的降解作用，因此能穩(wěn)定存在，不受環(huán)境影響，從而具有成為疾病診斷及預后的生物學指標的潛能。

與人類心血管疾病相關的miRNA較多，有些miRNA與多種疾病相關，如miRNA-1既與心肌肥大[15]有關，也與心律失常[22，31]、心肌梗死[22]相關；一種疾病可能涉及多種miRNA，如急性冠脈綜合征病發(fā)后有17種miRNA表達改變[23]，這些miRNA可能通過不同的靶基因而單獨影響蛋白表達，也可能在蛋白合成的同一條途徑不同環(huán)節(jié)進行協(xié)同調節(jié)。相信隨著越來越多關于miRNA如何影響心血管疾病的深入研究，人類一定能找到某些心血管疾病特異性的miRNA，作為這些疾病診療及預后的新指標，并為心源性猝死死亡機制分析提供新思路。

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