高效液相色譜法測(cè)定散結(jié)止痛顆粒中芍藥苷含量

袁繼承　沙啟營(yíng)　呂偉斌　袁繼魯

散結(jié)止痛顆粒(批準(zhǔn)文號(hào)：魯藥制字再Z17080034)是菏澤市中醫(yī)醫(yī)院一種主治各種乳腺增生的中藥制劑，具有理氣活血、散結(jié)止痛的功效，適用于治療氣滯血瘀痰凝而致的乳房脹痛、乳腫結(jié)塊等各種類型的乳腺增生疾病。該醫(yī)院制劑已使用多年，臨床療效好，具有開發(fā)上市前景。

散結(jié)止痛顆粒全方由香附、赤芍、當(dāng)歸、柴胡等共十六味中藥組成，赤芍為本制劑的君藥，具有清熱涼血、散瘀止痛功效。赤芍總苷具有較強(qiáng)的清除自由基和抗凝血活性[1]；其中芍藥苷(paeoniflorin)是赤芍總苷的主要活性成分，在總苷中含量占75%以上[2]，具有多種生物作用，如抗菌抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能[3-4]，所以測(cè)定芍藥苷含量可以控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量。由此建立了測(cè)定散結(jié)止痛顆粒中芍藥苷含量的高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)。

1　儀器與試藥

日本島津LC-10ATVP液相色譜儀，SPD-10Avp紫外檢測(cè)器；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D電子天平。

芍藥苷(批號(hào)：110736-200525)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純；水為純凈水；散結(jié)止痛顆粒樣品均為菏澤市中醫(yī)醫(yī)院制劑科自制。

2　方法與結(jié)果

2.1　色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)[5]

色譜柱：依利特Hypersil ODS2 高效液相色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙睛—水(17：83)；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；芍藥苷的理論塔板數(shù)不低于3000。經(jīng)過多種芍藥苷的測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)比較，本方法對(duì)芍藥苷分離效果好，同時(shí)陰性樣品無(wú)干擾，且洗脫時(shí)間短，因此，最終采用上述芍藥苷的高效液相色譜條件。

2.2　對(duì)照品溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取芍藥苷對(duì)照品5.24 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為0.524 mg/ml的芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2.5 ml，置于5 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為262.0 mg/ml的芍藥苷對(duì)照品溶液。

芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密吸取配制的芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2 ml，分別置于2 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度為52.4、104.8、157.2、209.6、262.0、393.0、524.0 μg/ml的芍藥苷對(duì)照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣10 μl于色譜儀中測(cè)定。結(jié)果芍藥苷濃度在52.4～524 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=6341.9X+76190，r=0.9999。

2.3　供試品溶液制備

精密稱定2.0 g散結(jié)止痛顆粒(批號(hào)：20100503)，用50 ml甲醇為溶劑分兩次進(jìn)行超聲提取，每次超聲15分鐘，放冷，稱重，濾過，得續(xù)濾液于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，定量轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度即得供試品溶液。

2.4　專屬性試驗(yàn)

根據(jù)處方中各藥味的比例，按照散結(jié)止痛顆粒制備工藝制備不含赤芍的顆粒，按照供試品提取條件及制備方法配制空白溶液，用高效液相色譜法測(cè)定，結(jié)果該空白溶液與散結(jié)止痛顆粒溶液的HPLC色譜圖在相應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)吸收，表明該方法對(duì)散結(jié)止痛顆粒中芍藥苷的測(cè)定具有專屬性，可以用于散結(jié)止痛顆粒的芍藥苷含量測(cè)定(見圖1)。

2.5　對(duì)照品和樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取芍藥苷對(duì)照品溶液和供試品溶液分別于配制后1小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)分別連續(xù)3次依法測(cè)定峰面積，結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和供試品溶液在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.6　精密度試驗(yàn)

精密吸取濃度為262.0 μg/ml的對(duì)照品溶液10 μl于色譜儀中，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算其峰面積的RSD為0.44%，表明精密度較好。

2.7　重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批散結(jié)止痛顆粒5份，按照2.2方法測(cè)定樣品中芍藥苷含量，計(jì)算樣品RSD為2.80%，表明重現(xiàn)性良好。

2.8　回收率試驗(yàn)

精密稱取己知含量的同一批散結(jié)止痛顆粒6份，分別精密加入一定量的芍藥苷儲(chǔ)備液，用供試品溶液方法提取濃縮，定量轉(zhuǎn)移至5 ml容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度。依法測(cè)定，并計(jì)算回收率, 平均回收率為99.76%，RSD為4.68%。表明本法具有良好的回收率。

2.9　樣品測(cè)定結(jié)果

取5批次散結(jié)止痛顆粒樣品，按照所述方法進(jìn)行芍藥苷測(cè)定含量，每批3次，結(jié)果見表1。

表1　5批樣品中芍藥苷含量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)中國(guó)藥典2010年版一部對(duì)赤芍藥材中芍藥苷不得少于1.8 %的規(guī)定，結(jié)合制備的5批樣品中芍藥苷的含量測(cè)定結(jié)果，最低含量1.42 mg/g，最高含量2.15 mg/g，故初步暫定散結(jié)止痛顆粒中芍藥苷(C23H28O11)的含量不得小于1.5 mg/g。每袋裝量12 g，則本品含芍藥苷的量每袋不小于18.0 mg。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相系統(tǒng)的確定時(shí)，分別考察了甲醇—水、甲醇—0.1%磷酸溶液兩種流動(dòng)相[6]，結(jié)果芍藥苷分離不完全，受到其他成分一定的干擾，且峰型不好，故選擇乙腈—水系統(tǒng)，確定乙腈—水溶液(17∶83)為流動(dòng)相時(shí)，芍藥苷的分離度、峰型均較好，符合測(cè)定含量的要求。

在制備供試品溶液的提取方法中，分別考察了提取方法和時(shí)間、提取次數(shù)、提取溶劑及其使用量對(duì)芍藥苷的影響。首先參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]初步采用甲醇提取芍藥苷，在提取方法選擇上，結(jié)果超聲提取比回流提取簡(jiǎn)單易操作，并可以達(dá)到提取完全的

目的，故采用超聲提取方法；在超聲時(shí)間和溶媒用量上，通過多次試驗(yàn)，結(jié)果50 ml甲醇分兩次提取，每次超聲15分鐘即可將芍藥苷提取完全。

該醫(yī)院制劑成分復(fù)雜，多年臨床應(yīng)用證明其安全、有效，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)成品進(jìn)行兩味藥材定性鑒別，未建立中間產(chǎn)品及成品定量檢測(cè)控制標(biāo)準(zhǔn)。為保證藥品質(zhì)量，本試驗(yàn)建立的散結(jié)止痛顆粒中芍藥苷含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、結(jié)果可靠，能有效地控制散結(jié)止痛顆粒的質(zhì)量，保證了臨床療效的穩(wěn)定，并可為進(jìn)一步申報(bào)中藥新藥做好準(zhǔn)備。

[1]樸田,莫曉燕,林瑞崢.赤芍總苷提取液體外清除自由基和抗凝血活性的研究[J].中國(guó)藥房,2007,19(9),643-646.

[2]馬雙成,鄧少偉.赤芍總苷的生產(chǎn)工藝條件研究[J].中草藥,1998,29(10):664．

[3]華東,吳明媛,于曉紅,等.赤芍總苷對(duì)荷瘤鼠細(xì)胞免疫功能的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2004,32(1):47.

[4]王曉玉,魏偉,唐麗琴,等.芍藥苷對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及其產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,42(2):191-192.

[5]吳洪文,李明艷.高效液相色譜法測(cè)定蝎龍酒中芍藥苷的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2010,30(17):1486.

[6]侯林中,裴玉書,張熙潔,等.HPLC法測(cè)定寬心口服液中芍藥苷的含量[J].中國(guó)藥房,2011,22(31),2933-2934.

[7]李文博,韓建平,倪倩,等.SPE-UPLC法測(cè)定養(yǎng)血清腦顆粒中的芍藥苷含量[J].藥物分析雜志,2011,31(7):1385-1388.