石薺 提取物對流感病毒感染小鼠氧自由基損傷的保護作用＊

臧家娜，鄧麗麗，余陳歡，方 杰，應華忠，吳曉寧

(1．浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053;2．浙江省醫(yī)學科學院，浙江 杭州 310000;3．浙江醫(yī)學高等?？茖W校，浙江 杭州 310053)

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒感染引起的常見的呼吸道急性傳染病。臨床常用的西藥僅通過抑制病毒表面受體而發(fā)揮療效，極易產生耐藥性和不良反應[1]。中藥為中華民族瑰寶，在防治流感病毒方面具有獨特的優(yōu)勢。石薺 (M．scabra)為江浙地區(qū)常用中草藥，省地方標準收錄藥材，在我國分布廣闊，具有清熱解毒、理氣化痰的功效，主治流行時疫、痰濕內蘊、瘡毒和慢性支氣管炎等癥。項目組前期研究表明，石薺 提取物(MSE)可顯著改善流感病毒小鼠病理狀態(tài)，延長其存活時間，提高機體免疫水平[1-2]。此外其還具有抗炎[3]、抗氧化[4]等多種藥理作用，但其抗流感病毒的具體機制尚不清楚。因此，本試驗以氧自由基損傷為切入點，探討MSE改善流感病毒性肺炎的機制。

1 材料與方法

1．1 儀器、試藥與動物

DYQ-838型高速微型粉碎機(浙江瑞安永歷制藥機械有限公司);TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);DC300型萊卡圖像處理顯微鏡(德國萊卡公司)。石薺 藥材采于2009年8月浙江浦江，經本校俞冰副教授鑒定為石薺 (Mosla scabra Thunb．)的干燥全草，陰干、粉碎、過40目篩，備用;利巴韋林泡騰片(浙江艾康禮德制藥有限公司，批號為091210)。甲型流感病毒小鼠肺適應株A/PR/8/34，由浙江省疾病預防控制中心病毒所提供。病毒效價為1∶512。清潔級ICR小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SCXK(滬)2010-0014;10日齡SPF雞胚，由浙江省農業(yè)科學院提供。本試驗在浙江省醫(yī)學科學院ABSL2生物安全實驗室進行。

1．2 方法

石薺 提取物的制備:稱取石薺 干燥粗粉500 g，加藥材20倍量的70%乙醇，于90℃水浴回流提取3次，每次1．9 h，提取液減壓濃縮至含醇量10%左右抽濾，以除去樹脂、葉綠素等雜質[5]，繼續(xù)回收溶劑至無乙醇味，乙酸乙酯萃取，減壓干燥、粉碎，得棕黃色浸膏粉末，作為供試樣品(MSE)。臨用前以無菌生理鹽水溶解干浸膏粉末，配制成所需試驗藥物濃度。

分組及給藥:取清潔級ICR小鼠，雌雄各半，按體重隨機分為6組:正常對照組、病毒模型組、利巴韋林給藥組(75 mg/kg)和MSE高劑量給藥組(752 mg/kg)、中劑量給藥組(376 mg/kg)，低劑量給藥組(188 mg/kg)，每組10只。各組于攻毒前預先灌胃給藥3 d，每次給予0．2 mL/10 g，于第3天給藥2 h后在乙醚輕度麻醉下以10倍半數(shù)致死是(LD50)病毒量滴鼻感染小鼠，每只25 μL。連續(xù)給藥至第8天試驗結束。稱重，處死，迅速取肺組織稱重，計算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率，觀察肺臟形態(tài)，測定肺組織病毒載量[6-7]，并檢測肺組織勻漿液中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)活性。

1．3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(X ±s)表示，以 P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 化學成分定性檢查結果

通過堿性鋁鹽比色法測定了MSE中總黃酮的含量[1]，結果MSE中總黃酮以蘆丁計，其平均含量為83．3%。

2．2 MSE對流感感染小鼠肺指數(shù)及病毒載量的影響

結果見表1。可見，病毒模型組肺指數(shù)最大，與正常對照組比較，具有顯著性差異(P＜0．01)，MSE高、中、低各劑量給藥組均可明顯降低感染小鼠的肺指數(shù)，提高肺指數(shù)抑制率，減輕小鼠流感病毒所致肺炎的病變程度，并呈劑量依賴性;同時，MSE高、中、低各劑量給藥組肺組織中流感病毒載量明顯降低，其中MSE高劑量給藥組肺組織中流感病毒載量降低最顯著，與病毒模型組比較，具有顯著性差異(P ＜0．01)。

表1 MSE對流感感染小鼠肺指數(shù)及病毒載量的影響(n=10，X±s)

2．3 MSE 對感染小鼠肺組織 MDA，SOD，GSH-Px，NOS 和iNOS含量或活性的影響

結果見表2?？梢姡《灸Ｐ徒M感染小鼠肺組織中MDA含量、NOS及iNOS活性明顯升高，SOD和GSH-Px活性明顯降低，與正常對照組比較，具有顯著性差異(P＜0．01);MSE各劑量給藥組肺組織中各指標含量及活性均有不同程度的改善，且呈劑量依賴性。

表2 MSE對感染小鼠肺組織MDA，NOS，INOS，SOD，GSH-PX含量或活性的影響(X ± s，n=10)

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，病毒在肺組織內復制的過程中，炎癥細胞大量趨化、聚集和激活，并釋放過量的炎癥介質及氧自由基等，導致組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，通過抗氧化劑治療，可減少流感病毒感染小鼠的肺損傷和死亡[8-9]。因此，本試驗以氧自由基損傷為切入點，通過建立急性感染小鼠模型，探討MSE改善流感病毒性肺炎的機制。

正常情況下，機體內有一套清除自由基的酶系(超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px)，機體的氧化和抗氧化系統(tǒng)存在動態(tài)平衡，生理條件下體內自由基處于低濃度動態(tài)平衡。當機體受到損傷，或因某種因素體內自由基產生過多或清除能力降低時，體內活性氧自由基增多，體內脂質過氧化反應加劇。另外，MDA作為脂質過氧化的重要降解產物，可用于評價機體脂質過氧化損傷的程度[10]。NOS主要有結構型一氧化氮合酶(cNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)2種亞型，iNOS主要由被激活的膠質細胞、中性粒細胞和巨噬細胞釋放產生，一般在炎癥中后期大量生成且持續(xù)較長時間，是炎癥中后期腦損傷加重的重要因素[11]。

黃酮類化合物具有多酚結構，通過奪氫反應生成自由基中間體而阻斷或終止自由基連鎖反應鏈，從而阻止或抑制氧自由基反應和脂質過氧化反應，抑制脂質過氧化物及其代謝產物丙二醛MDA和共軛二烯等毒性物質的生成。同時，黃酮類化合物還可調節(jié)和提高體內抗氧化酶活性[2]。

本試驗結果表明，流感病毒感染后，病毒模型組小鼠肺組織中MDA含量、NOS活性及iNOS活性明顯增加，SOD，GSH-Px和T-AOC活性明顯下降，提示病毒感染肺組織存在明顯的脂質過氧化損傷及抗氧自由基損傷的能力下降。經MSE給藥干預后，小鼠肺組織中 SOD，GSH-Px和 T-AOC等活力增加，MDA含量明顯減少，NOS及iNOS活性明顯降低，提示流感感染小鼠肺組織脂質過氧化損傷明顯減輕，抗氧自由基損傷能力明顯增強。

綜上所述，MSE能夠有效減輕流感病毒引發(fā)的肺組織脂質過氧化損傷，提高機體的總抗氧化能力和抑制炎癥反應，這可能是其減輕流感病毒性肺炎病理損傷的作用機制之一。

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