豬肺炎支原體的免疫原蛋白及疫苗的研究進展*

崔娟娟，郝秀靜，張斯民，侯玉婷，李 敏

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川750021)

豬支原體肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of swine,MPS) 又稱豬喘氣病,是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一種慢性呼吸道傳染病，以接觸性、高傳染性、高發(fā)病率和低死亡率著稱，普遍存在于世界各地。該病一旦爆發(fā)便難以控制，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。為了解決豬肺炎支原體對養(yǎng)豬業(yè)造成的危害，很多國家的獸醫(yī)工作者及相關(guān)研究人員對疫苗做了大量研究。豬支原體肺炎滅活疫苗自20世紀(jì)90年代在美國注冊后，大量研究已經(jīng)證實了支原體疫苗給養(yǎng)豬業(yè)帶來的經(jīng)濟效益。目前，豬支原體肺炎疫苗仍被德國列入標(biāo)準(zhǔn)的免疫程序內(nèi)。本文從豬肺炎支原體的主要免疫原蛋白和疫苗研究兩方面對豬肺炎支原體的免疫學(xué)研究做一綜述，從而為豬肺炎支原體致病機理的進一步研究及該病的防治提供新思路。

1 豬肺炎支原體的主要免疫原蛋白

豬肺炎支原體主要有下幾種免疫原：細胞質(zhì)蛋白(胞內(nèi)具乳酸脫氫酶活性的蛋白p36)、膜蛋白(p46、p65和 p74)、粘附因子(主要為p97、p102、p216、p159、p116、Mhp107、Mhp271七種蛋白)以及核苷酸還原酶。

1.1 細胞質(zhì)蛋白

p36蛋白具有很強的保守性[1]。Strasser等[3]研究顯示，p36蛋白基因在豬肺炎支原體分離菌株中具有很強的保守性而且特異，其具有L乳酸脫氫酶(LDH)活性，并能引起感染豬的早期免疫反應(yīng)。另有研究報道，p36蛋白與細菌的LDH同源性很高，并由單順反子所編碼。Caron等[1]發(fā)現(xiàn)，p36重組蛋白在對照組與試驗組中豬血清中的抗體變化與臨床病理變化之間找不到必然的聯(lián)系，但換用其單克隆抗體卻可以檢測到豬肺炎支原體。祝永琴等[2]通過豬肺炎支原體p36基因在畢赤酵母中的表達研究表明p36蛋白基因在畢赤酵母中獲得表達，而且其反應(yīng)原性是相當(dāng)不錯的。這一研究結(jié)果為今后更好的研制基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1.2 膜蛋白

目前報道了三種具免疫優(yōu)勢的膜蛋白:p46、p65和p74。

1.2.1 p46蛋白 p46蛋白也具種屬特異性。Cheikh Saad Bouh等[4]研究證實p46和p65兩蛋白在種間的保守性和特異性均很高。Frey等[5]制備p46蛋白的單克隆抗體來檢測豬肺炎支原體，并取得良好的檢測效果。遲靈芝等[6]報道，已成功將豬肺炎支原體p46基因中編碼Trp的密碼子TGA定點突變?yōu)門GG，這將為p46蛋白基因的進一步研究及豬肺炎支原體抗體的檢測奠定了基礎(chǔ)。

1.2.2 p65蛋白 據(jù)報道，p65蛋白是Mhp的一個重要免疫原，C端是其主要的抗原表位區(qū)，p65蛋白可誘發(fā)早期的免疫應(yīng)答。Cheikh Saad Bouh等[4]報道了p65蛋白的種間保守性和特異性很高。Sehmidt等[7]報道，p65蛋白除了是Mhp關(guān)鍵的具免疫原性的膜蛋白之外，它還是一種解脂酶。如若使p65蛋白在大腸桿菌中成功表達，必須將其序列中的l個TGA密碼子進行定點突變。

1.2.3 p74 蛋白 有研究表明，p74蛋白除了是Mhp高度保守而特異的膜蛋白之外，還是一種熱休克蛋白。目前，只是初步研究了采用其單克隆抗體建立的阻斷ELISA的檢測方法，對于其它方面還有待于進一步的研究。

1.3 核苷酸還原酶[8]

Fagan等發(fā)現(xiàn)了一個跟原核生物NrdF的R2亞基C末端具同源性與Mhp高免血清反應(yīng)的克隆片段，將該片段克隆到沙門氏菌表達系統(tǒng)中，可檢測到分子量大小為15 kD的一個雜合蛋白，而且其抗血清對Mhp的生長具抑制作用。將其制備的活疫苗通過口服免疫小鼠后，可在小鼠體內(nèi)檢測到肺部粘膜分泌的IgG和lgA與血清中抗重組NrdF都呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。還發(fā)現(xiàn)只用雜合蛋白去免疫小鼠，結(jié)果檢測到的IgG量沒有注射重組蛋白的多。后來，Austen Y Chen等在不同的沙門氏菌表達系統(tǒng)中表達插入的NrdF并比較分析了其免疫效果，雖然都出現(xiàn)了細胞免疫，但其效果因在表達系統(tǒng)中所用到的載體不同而各異。

1.4 粘附因子[9]

豬肺炎支原體與呼吸道的特異性粘附是引起豬支原體肺炎的首要條件。豬肺炎支原體對豬呼吸道的黏附是多個黏附因子共同作用所致，但其黏附機制還不是很清楚。目前，已報道了多個黏附因子，本文主要對以下幾個粘附因子做一總結(jié)。

1.4.1 p97蛋白 p97蛋白是最早也是目前研究較為透徹的一個黏附因子。

有研究顯示， p97的C端是其主要的黏附區(qū)域，該區(qū)域包括R1和R2兩個重復(fù)序列，而且構(gòu)成R1和R2的重復(fù)單元是不同的，所以其黏附能力也表現(xiàn)出了差異。

Cheryl等[10]在體外對p97蛋白進行了分段表達，發(fā)現(xiàn)p97N端蛋白和C端蛋白都能與肝磷脂黏附。分別對位于C端蛋白的R1和R2區(qū)分別進行表達，發(fā)現(xiàn)R1和R2區(qū)對肝磷脂的黏附都是不可缺少的。

Faust等[11]研究發(fā)現(xiàn)，免疫組豬的肺部病變較未免疫組的有所降低且豬群日增重有所增加。還發(fā)現(xiàn)，商品化的疫苗比p97亞單位疫苗產(chǎn)生更全面的免疫保護。這暗示：除p97蛋白外，在豬肺炎支原體中可能還存在著其它的毒力因子或抗原。

1.4.2 p102蛋白 Minion等[12]的研究相繼表明，在p97基因下游不到30 bp出有一個可編碼約102 kDa蛋白的ORF，根據(jù)該蛋白的大小將其命名為p102。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，p102基因約占基因組全序列的13%，而且至少有4個拷貝。Adams等[13]研究了p97蛋白和p102蛋白及其旁系同源類似物在體內(nèi)的表達情況，得出：p97和p102兩蛋白以及它們的旁系基因竟位于同一轉(zhuǎn)錄區(qū)，而且在被感染的宿主體內(nèi)都檢測到了這兩種蛋白。有研究推測，p102蛋白對p97蛋白的黏附具有輔助功能，而且其自身可能也具潛在的吸附纖毛的能力，當(dāng)然，這僅僅是一個推測，還需進一步的驗證。郭丹等[14]成功制備了具有免疫優(yōu)勢的p102蛋白，這一成果為研制新一代疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。

1.4.3 p159蛋白 Tracey等[15]發(fā)現(xiàn)p159蛋白也是豬肺炎支原體表面的一種黏附因子， 該蛋白一經(jīng)表達后，便裂解為110、52、27 kDa三種蛋白，這三種蛋白在各個生長階段的Mhp表面都可檢測到。其中，p52蛋白在豬肺炎支原體的不同菌株中是相對保守的，其位于p159蛋白C末端區(qū)域；據(jù)報道，抗p52的蛋白血清能夠減弱豬肺炎支原體對真核細胞的黏附，這說明了p159蛋白在黏附真核細胞過程中，p52蛋白扮演了重要角色。曹培麗等[16](2009)報道了p52蛋白能與豬肺炎支原體陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，由此說明p52蛋白有相當(dāng)不錯的反應(yīng)原性；p52蛋白是p159蛋白中的關(guān)鍵水解蛋白。對于p27蛋白而言，只知道它存在于p159蛋白的N端，具體功能還未見報道。另有研究表明，對于處于自然結(jié)構(gòu)的p110蛋白，它能夠阻止豬肺炎支原體對豬氣管上皮細胞提取物的黏附。

1.4.4 p216蛋白 Jody等[17]發(fā)現(xiàn)了由Mhp 493編碼的一個p97蛋白的同源類似物，并將該同源類似物命名為p216蛋白。該蛋白可裂解為120和85 kDa的兩種蛋白，這兩種蛋白都是能與肝磷脂結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)胰酶消化試驗證實了這兩種蛋白都存在于細胞表面。他們對p216蛋白在體外進行分段表達試驗結(jié)果中得出：蛋白的每段都能粘附并進入PK15細胞。p216蛋白是目前報道的唯一一個無R1纖毛結(jié)合區(qū)卻可以與肝磷脂結(jié)合的蛋白。

1.4.5 p116蛋白 Lisa等[18]也發(fā)現(xiàn)了由Mhp108編碼的一個p102蛋白的同源類似物，該同源類似物便是p116蛋白。在p102蛋白家族中，p116蛋白也是第一個發(fā)現(xiàn)的能夠黏附豬呼吸道和pK15細胞的黏附因子。而且p116蛋白也是首次報道的可與纖溶酶原相結(jié)合的黏附因子。據(jù)報道，p116蛋白是豬肺炎支原體關(guān)鍵的黏附因子和毒力因子，這為豬肺炎支原體的致病機理提供了有力的依據(jù)。

1.4.6 Mhp271蛋白 Ania等[19]報道了p97蛋白的另一個同源類似物，即Mhp271蛋白，其分子量大小約為118 kDa。Mhp271蛋白是目前報道的包括p97蛋白在內(nèi)的，具有R1和R2兩個區(qū)域的蛋白。為了探究Mhp271蛋白的功能，有關(guān)研究顯示：豬肺炎支原體黏附過程中，Mhp271蛋白的R1區(qū)和R2區(qū)都是不可或缺的。

1.4.7 Mhp107蛋白 Lisa等[20]發(fā)現(xiàn)繼Jody、Ania等報道后第三個p97蛋白的同源類似物，即Mhp107蛋白。Lisa等人的研究顯示：Mhp107蛋白存在于細胞膜；可以與纖溶酶原、纖連蛋白和肝磷脂相結(jié)合發(fā)揮其功能；能夠黏附PK15細胞和豬的呼吸道。這意味著Mhp107蛋白是多功能的，而且還是豬肺炎支原體的一個關(guān)鍵的毒力因子和黏附因子。

根據(jù)上述7種主要黏附因子的介紹，可總結(jié)出：(1) p116蛋白和Mhp107蛋白可作為今后亞單位疫苗的候選者。(2)p116、Mhp271和Mhp107三種蛋白黏附宿主細胞的特性為豬肺炎支原體感染宿主細胞的粘附機理提供了可參考的價值[21-22]。除此之外，也為其他病原微生物黏附至細胞外基質(zhì)上的纖連蛋白提供了依據(jù)[20]。(3)具有肝磷脂黏附區(qū)域的四種黏附因子(p97、p159、p216、Mhp271和Mhp107蛋白)對細胞的黏附表明：豬肺炎支原體在黏附過程中，肝磷脂扮演了重要角色，這也為研究致病機制及制備豬肺炎支原體疫苗提供了新思路。

2 豬肺炎支原體疫苗的研究

目前報道的豬肺炎支原體疫苗主要有：滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。

2.1 滅活疫苗

豬支原體肺炎滅活疫苗主要激發(fā)機體的體液免疫[21]。Villarreal等[22]報道了滅活疫苗主要激發(fā)機體的體液免疫。但Procajlo等[23]已報道，滅活疫苗中若加入相應(yīng)的佐劑便能引發(fā)機體的細胞免疫。Vranckx等[24]報道，對于經(jīng)強豬肺炎支原體毒株感染后支氣管相關(guān)淋巴組織內(nèi)巨噬細胞的浸潤能力可被輝瑞公司生產(chǎn)的Mhp滅活疫苗降低。但Kick等[25]報道，滅活疫苗能夠產(chǎn)生的細胞免疫能力是相當(dāng)有限的。同年，Regia Silva Sousa 等[26]報道，Mhp疫苗可發(fā)生細胞免疫，但其免疫效果因豬的品種而異。Tzivara等[27]對兩個豬場的豬進行了Mhp滅活疫苗的治療效果的試驗，得出的結(jié)論是：免疫豬雖沒表現(xiàn)出臨床癥狀，但體重均有所增加。Reynolds等[28]報道，在滅活疫苗中加入礦物油卵磷脂類佐劑其免疫效果良好。但Reynolds等[29]報道，某些情況下，滅火疫苗的成本要比豬肺炎支原體感染造成的損失更大，考慮到經(jīng)濟效益，是否選擇滅活疫苗各個豬場要視其具體情況而定。

2.2 弱毒疫苗

目前投入生產(chǎn)并廣泛使用的Mhp弱毒活疫苗為Mhp168弱毒株，研究均表明其經(jīng)肺內(nèi)注射后可突破母源抗體屏障。Feng等[30]報道，Mhp弱毒活疫苗經(jīng)肺內(nèi)注射后，其能突破母源抗體的影響并引發(fā)機體產(chǎn)生局部粘膜及細胞免疫。Li等[31]報道，添加佐劑的Mhp弱毒活疫苗可有效增加體液、細胞及粘膜免異的效果。

最新研究顯示，占位效應(yīng)被認為是弱毒活疫苗獨特的免疫機制之一。周勇岐等[34]報道，Mhp弱毒活疫苗經(jīng)肺內(nèi)注射后，疫苗可占據(jù)肺泡表面所有可占用的空間，若此時，豬再次感染Mhp野毒株，肺泡表面已無空位可占，從而降低了豬肺炎支原體肺炎發(fā)生的概率。劉茂軍等[35]用Mhp弱毒株對豬場的7000多頭豬進行了臨床試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其免疫效果很顯著。王曉陽等[32]研究規(guī)模豬場偽狂犬弱毒疫苗滴鼻免疫的效果時發(fā)現(xiàn)，弱毒疫苗菌株可通過占位效應(yīng)來阻止野毒的感染。

2.3 基因工程疫苗

因豬肺炎支原體存在的密碼子跟通用密碼子有出入，使得豬肺炎支原體抗原蛋白在其他物種中難以表達，如若想在大腸桿菌系統(tǒng)中表達豬肺炎支原體抗原蛋白，就必須成功定點突變TGA為TGG才可行，所以生產(chǎn)疫苗便遇到了瓶頸。雖然如此，基因工程疫苗研究已有部分突破。

2.3.1 核苷酸還原酶(NrdF)的R2亞基重組疫苗[8]前面提過到了核甘酸環(huán)酶的一些特性，這里將簡單介紹下，它在疫苗方面的應(yīng)用及發(fā)展的狀況。Fagan等發(fā)現(xiàn)了一個跟原核生物NrdF的R2亞基C末端具同源性與Mhp高免血清反應(yīng)的克隆片段，將該片段克隆到沙門氏菌表達系統(tǒng)中，可檢測到分子量大小為15 kD的一個雜合蛋白，而且其抗血清對Mhp的生長具抑制作用。將其制備的活疫苗通過口服免疫小鼠后，可在小鼠體內(nèi)檢測到肺部粘膜分泌的IgG和lgA與血清中抗重組NrdF都呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。還發(fā)現(xiàn)只用雜合蛋白去免疫小鼠，結(jié)果檢測到的IgG量沒有注射重組蛋白的多。后來，Austen等在不同的沙門氏菌表達系統(tǒng)中表達插入的NrdF并比較分析了其免疫效果，雖然都出現(xiàn)了細胞免疫，但其效果因在表達系統(tǒng)中所用到的載體不同而各異。

2.3.2 表達文庫免疫 所謂的表達文庫免疫是指從豬肺炎支原體表達文庫中篩選能表達豬肺炎支原體抗原的克隆制備抗原并免疫動物。研究報道，由經(jīng)過改造的大腸桿菌質(zhì)粒表達載體建立的豬肺炎支原體的表達文庫，其保護效果良好。對于表達文庫免疫的其他相關(guān)研究目前還未見報到，我們期待有更好的新發(fā)現(xiàn)。

2.3.3 粘附因子相關(guān)疫苗 研究報道，通過粘附因子與其他菌融合而制備的亞單位疫苗對動物的免疫效果相對良好。Okamba等[36]報道將rAdp97C以肌注和滴鼻兩種方式來免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其免疫效果很顯著。王亮等也證實Dnak-p97可刺激小鼠產(chǎn)生針對p97的抗體。

2.3.4 DNA疫苗 目前，對DNA疫苗的研究相對來說很少，Chen等[37]報道，通過構(gòu)建DNA疫苗(pcDNA3/p42)并使其免疫小鼠，結(jié)果檢測到IgGI、IgG2a、mRNA、IL-4、IL-2和IFN-γ在小鼠體內(nèi)均呈上升趨勢，還檢測到脾細胞的增殖能力也大大加強了。

2.3.5 肽疫苗 肽疫苗作為新近發(fā)展起來的疫苗，它有傳統(tǒng)疫苗不可比擬的優(yōu)勢，如其抗原成分簡單，毒力不易恢復(fù)等等，但對其的研究報道目前還不多見。最新的研究報道顯示，在肽疫苗的設(shè)計方面，噬菌體肽庫的構(gòu)建及篩選技術(shù)具有巨大的潛力，希望經(jīng)篩選到的噬菌體抗原決定簇成為一種肽疫苗，當(dāng)然，這需要進一步的功能實驗研究。

3 展 望

豬支原體肺炎在世界范圍內(nèi)廣泛存在,它具有發(fā)病率高、死亡率低的特點,該病一旦在豬場爆發(fā)便很難對其控制，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，我國也不例外。所以，研究它的致病機理找出有效的預(yù)防和控制該疾病的方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

以目前報道的豬肺炎支原體的主要免疫原蛋白的免疫機理及疫苗發(fā)展的狀況出發(fā)，今后應(yīng)從以下方面著手:第一，發(fā)展高效的滅活疫苗和相應(yīng)的免疫增效佐劑。就豬支原體肺炎滅活疫苗而言，首先，母源抗體對其有較大的影響，在使用時我們應(yīng)采取相應(yīng)的措施來避開這一影響。其次，如何生產(chǎn)具有高純度和高滴度的滅活疫苗是目前頗為關(guān)注的問題，而且也是國際支原體組織在2012年大會上的五項主要議題之一。Villarreal等[38]與Chae[39]的最新研究表明，滅活疫苗并不能阻止野毒的感染。所以，我們要對豬支原體肺炎滅活疫苗進行優(yōu)化:(1)選擇高效而低毒的免疫增效佐劑來激發(fā)機體的細胞免疫并盡可能的減少免疫應(yīng)激。(2)改善現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝以得到高純度和高滴度的抗原。(3)具良好的免疫原性應(yīng)作為篩選菌株或者抗原最低標(biāo)準(zhǔn)。Simionatto等[40]對34個Mhp重組蛋白的免疫原性研究的結(jié)果為今后研發(fā)更高效的Mhp疫苗提供了可靠的依據(jù)。

第二，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上繼續(xù)開發(fā)弱毒疫苗。為保證其高效免疫，我們可采取以下三項免疫措施：(1)使用弱毒活疫苗時，我們應(yīng)采取早期免疫方式以保證弱毒疫苗的有效活力。(2)考慮到操作繁瑣這一問題，我們可采用肺內(nèi)免疫的途徑，而且效率也高。(3)考慮到豬場還有其他疾病存在，在使用疫苗的同時還要使用各種抗生素，所以我們應(yīng)選擇肺炎支原體非敏感抗生素，以免降低其免疫效果。

第三，基因工程疫苗的研究相對來說較緩慢,應(yīng)加大力度研制出更為高效實用的基因工程疫苗也是今后制備疫苗的一個重要措施。

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