益氣活血方對(duì)心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能的影響及其細(xì)胞凋亡機(jī)制

韓樹山 吳愛明 張冬梅 呂唏瀅 趙明鏡 柴立民 聶波 金秋碩 趙一舟王碩仁 婁利霞

心力衰竭是一個(gè)由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈或射血減少的復(fù)雜臨床綜合征。中醫(yī)治療心力衰竭具有一定的特色和優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)認(rèn)為心力衰竭的病因病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)、氣虛陽虛為本，血瘀水泛為標(biāo)。其中又以氣虛血瘀為主。益氣活血方以人參、黃芪、當(dāng)歸為組分，在以往的研究中證實(shí)可以降低心肌梗死的死亡率，提高冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的運(yùn)動(dòng)耐量［1］。為了進(jìn)一步探討益氣活血方改善心功能的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在在體的心力衰竭模型上，觀察益氣活血方處理對(duì)心力衰竭時(shí)心功能的影響及其細(xì)胞凋亡機(jī)制，以論證益氣活血方對(duì)心力衰竭心臟的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量(200±10)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(京)2009-0007。

1.2 藥物的制備

益氣活血方由人參1 g、黃芪13 g 和當(dāng)歸6 g 組成，藥物使用免煎顆粒，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院。常溫干燥保存。

1.3 儀器

RSP-1002 型呼吸機(jī)(Kent Scientific Corporation)，心電示波儀(上海醫(yī)學(xué)電子儀器廠XJ-11型)，千分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司JA1003N 型)，中日合資AloCa5000 彩色超聲診斷儀，CL15-7 高頻線陣探頭(7-15MHz)，BX60 熒光透射顯微鏡(日本Olympus 公司)，SpotⅡ數(shù)碼成像系統(tǒng)(美國Diagnostic Instruments 公司)，IpWin5 圖象分析軟件。

1.4 動(dòng)物模型制備［2］

大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉50 mg/kg 體重腹腔麻醉后，背位固定，左胸前區(qū)備皮，消毒。經(jīng)喉行氣管插管術(shù)，連接呼吸機(jī)，80 次/分鐘，潮氣量0.7 ～0.8 ml，在左側(cè)第三四肋骨間橫向切開皮膚約1.5 cm，鈍性分離肌層，沿第三四肋骨間隙打開胸腔，開胸器固定。打開心包，暴露心臟。在動(dòng)脈圓錐左心耳之間下方約2 mm 處用5/0 線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。當(dāng)心電圖I 導(dǎo)聯(lián)顯示ST 段顯著抬高后，重置心臟于胸腔，并立即分層縫合胸壁。術(shù)后注射青霉素(80萬單位/只)連續(xù)3 天。假手術(shù)組手術(shù)過程同上，但只穿線不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。模型組和假手術(shù)組動(dòng)物術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 動(dòng)物分組及給藥

大鼠左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)死亡率20%。成活的模型大鼠隨機(jī)分為益氣活血低劑量組、益氣活血高劑量組、生理鹽水對(duì)照組和西藥對(duì)照組(酒石酸美托洛爾)，每組8 只。按如下方法給藥:益氣活血低劑量組按2 g/(kg·d)給藥劑量灌胃益氣活血高劑量組按20 g/(kg·d)灌胃，酒石酸美托洛爾組按12 mg/(kg·d)給藥劑量灌胃，生理鹽水對(duì)照組、和正常組大鼠給以和治療組同等容積的生理鹽水灌胃，每日一次，于造模后24 小時(shí)開始，連續(xù)給藥8 周后進(jìn)行小動(dòng)物心動(dòng)超聲檢測(cè)以及心臟組織取材。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 大鼠超聲心動(dòng)圖測(cè)定 大鼠連續(xù)給藥8 周后，1%戊巴比妥鈉50 mg/kg 體重腹腔麻醉，仰臥位固定于鼠板，胸部備皮，應(yīng)用超聲診斷儀和高頻線陣探頭檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)和功能。心臟的檢測(cè):取胸骨旁左室長軸切面，由二維超聲引導(dǎo)M 型曲線進(jìn)行測(cè)量。超聲測(cè)定指標(biāo):(1)左室后壁舒張末期厚度(left ventricular posterior wall end-diastole thickness，LVPWTd)、左室后壁收縮末期厚度(left ventricular posterior wall end-systolic thickness，LVPWTs)、室間隔舒張末期厚度(interventricular septum end-diastolic thickness，IVSTd)、室間隔收縮末期厚度(interventricular septum end-systolic thickness，IVSTs);(2)左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter LVDs);(3)左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening，LVFS)。以上每一項(xiàng)超聲測(cè)定指標(biāo)均取3 個(gè)測(cè)量值后取平均值。

表1 大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后益氣活血方干預(yù)8 周心動(dòng)超聲檢測(cè)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)

表1 大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后益氣活血方干預(yù)8 周心動(dòng)超聲檢測(cè)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)

注:與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01

組別 n 度左(室L后V P壁W舒T d張)(末cm厚)度左(室L后V P壁W收T s縮)(末cm厚)室(間I V隔ST舒d)張(c厚m)度 室(間IV隔ST收s)縮(c厚m)度左室(L舒VD張d末)(期cm內(nèi))徑左室(L收VD縮s)末(期c m內(nèi))徑假手術(shù)組 8 0.17±0.03 0.28±0.04 0.15±0.03 0.32±0.05 0.70±0.05 0.36±0.05模型組 8 0.19±0.03 0.25±0.03 0.17±0.05 0.24±0.07a 0.81±0.09b 0.58±0.07b酒石酸美托洛爾組 8 0.22±0.06 0.27±0.06 0.16±0.04 0.21±0.07 0.84±0.09 0.60±0.09益氣活血小劑量組 8 0.21±0.04 0.29±0.06 0.18±0.02 0.27±0.06 0.81±0.11 0.51±0.13益氣活血大劑量組 8 0.20±0.03 0.26±0.03 0.18±0.03 0.25±0.08 0.85±0.04 0.59±0.10

1.6.2 大鼠臟體比值的測(cè)定 大鼠連續(xù)給藥8周，實(shí)驗(yàn)完畢后剪取大鼠心臟，用生理鹽水沖洗殘余的血液，輕輕擠出殘余液體，用電子天平稱量全心重量(HW)，計(jì)算心臟臟體比值。心臟臟體比值(mg/g)=全心重量(HW)/體重(g)

1.6.3 TUNEL 染色(參照武漢博士德生物制品公司試劑盒說明) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫，室溫處理10 分鐘后蛋白酶K 37 ℃消化10 分鐘。新鮮配制標(biāo)記緩沖液37 ℃孵育2 小時(shí)，封閉液室溫封閉30 分鐘。生物素化地高辛抗體37 ℃反應(yīng)30 分鐘，0.01 mol/L TBS 洗。鏈霉親和素-過氧化物酶(SABC)37 ℃反應(yīng)30 分鐘，0.01 mol/L TBS洗5 分鐘×4 次。加3，3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色。輕度蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。脫水，透明，封片光鏡檢查。用PBS 做陰性對(duì)照，陽性為棕黃色。選取非梗死區(qū)域進(jìn)行TUNEL 陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠術(shù)后給藥8 周心動(dòng)超聲檢測(cè)

通過小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖觀察檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)變化及其收縮和舒張功能。在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后8周，大鼠的心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生了重構(gòu)，與假手術(shù)組比，模型組大鼠的心臟LVDd、LVDs 顯著增加(P ＜0.05)，與模型組相比，各藥物組對(duì)超聲心動(dòng)的各形態(tài)學(xué)指標(biāo)沒有影響(P ＞0.05)。與假手術(shù)組比，模型組大鼠的心臟LVEF%、LVFS%顯著降低(P ＜0.05)，與模型組比，給予益氣活血方小劑量可以顯著改善LVEF%、LVFS%(P ＜0.05)，而大劑量益氣活血方有改善LVEF%、LVFS%的趨勢(shì)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1、表2。

表2 大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后益氣活血方干預(yù)8 周心動(dòng)超聲檢測(cè)的功能學(xué)指標(biāo)

表2 大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后益氣活血方干預(yù)8 周心動(dòng)超聲檢測(cè)的功能學(xué)指標(biāo)

注:與假手術(shù)組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05

組別 n 左(L室VE射F血)(分%數(shù))左室(L短VF軸S縮)(短%分)數(shù)假手術(shù)組8 86.70±3.03 51.33±3.89模型組 8 57.13±13.53a 28.35±8.55a酒石酸美托洛爾組 8 61.16±9.95 30.86±5.31益氣活血小劑量組 8 72.74±9.99b 38.15±8.26b益氣活血大劑量組8 63.60±12.38 31.05±8.51

2.2 大鼠臟體比值

術(shù)后給藥8 周，測(cè)定大鼠心臟的臟體比值作為評(píng)價(jià)心肌重構(gòu)的指標(biāo)。模型組臟體比值高于假手術(shù)組，但是兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，給予酒石酸美托洛爾及益氣活血方都有降低大鼠臟體比值的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表3。

表3 各組動(dòng)物心臟臟體比值

表3 各組動(dòng)物心臟臟體比值

組別 n 臟體比值(mg/g)假手術(shù)組8 0.29±0.04模型組 8 0.33±0.04酒石酸美托洛爾組 8 0.30±0.05益氣活血小劑量組 8 0.29±0.02益氣活血大劑量組8 0.31±0.03

2.3 TUNEL 染色方法檢測(cè)給藥8 周后大鼠心肌組織的細(xì)胞凋亡

每組動(dòng)物隨機(jī)選取6 只，做組織切片，進(jìn)行TUNEL 凋亡染色。假手術(shù)組(A)大鼠的心肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡陽性染色很少，模型組大鼠(B)心肌細(xì)胞TUNEL 染色陽性細(xì)胞核顯著增高(與假手術(shù)組比較，P ＜0.01)，酒石酸美托洛爾可以明顯抑制冠狀動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生(與模型組比較，P ＜0.05)。益氣活血小劑量(C)和大劑量(D)也可以明顯抑制冠狀動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型心肌組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生(P ＜0.05、P ＜0.01)。見圖1、表4。

表4 TUNEL 染色方法檢測(cè)給藥8 周后大鼠心肌組織的細(xì)胞凋亡陽性率

表4 TUNEL 染色方法檢測(cè)給藥8 周后大鼠心肌組織的細(xì)胞凋亡陽性率

注:與假手術(shù)組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05，cP ＜0.01。由于每組有2 只動(dòng)物取材專門用做氧化應(yīng)激損傷及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，故該檢測(cè)指標(biāo)樣本量為6。

組別 n 心肌細(xì)胞凋亡陽性率(%)假手術(shù)組6 1.97±1.27模型組 6 8.86±2.35a酒石酸美托洛爾組 6 5.99±1.70b益氣活血小劑量組 6 5.96±2.41b益氣活血大劑量組 6 3.86±1.55c

3 討論

細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)一種與細(xì)胞壞死截然不同的自殺程序，是在基因控制下的主動(dòng)死亡。研究表明心肌梗死后心室重構(gòu)和心肌由代償性肥厚到心力衰竭轉(zhuǎn)變過程中存在心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。心肌細(xì)胞的缺失(死亡和凋亡)和心室重構(gòu)是心功能下降的最主要的原因［3］。中醫(yī)針對(duì)心力衰竭氣虛血瘀的基本病機(jī)，使用益氣活血方可以改善心肌梗死后心功能［4］。

圖1 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎大鼠模型給藥8 周后心肌組織TUNEL 染色

本研究在大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎模型上，給以由黃芪、人參、當(dāng)歸組成的益氣活血方，8 周后測(cè)定心功能及心肌組織細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明:此方藥可以減輕心肌梗死后的心室重構(gòu)，改善心功能。與模型組比，給予益氣活血方小劑量可以顯著改善LVEF%、LVFS%(P ＜0.05)，大劑量益氣活血方有改善LVEF%、LVFS%的趨勢(shì)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這個(gè)結(jié)果可能與模型制備的手術(shù)操作較為復(fù)雜和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的例數(shù)限制有關(guān)。心肌組織的TUNEL 染色結(jié)果還顯示此益氣活血方抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這可能是此方藥減輕心肌梗死后的心室重構(gòu)，改善心功能的重要機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)所用益氣活血方的主要成分黃芪為益氣藥，大量研究表明黃芪對(duì)缺血心肌有多重保護(hù)作用。它保護(hù)線粒體及溶酶體的功能、能夠增加cAMP 的含量、降低心肌耗氧量，增加心肌抗缺氧能力，另外黃芪還具有消除自由基的作用［5］。此方藥的另一主要成分人參及其提取物人參皂苷被證實(shí)能改善心肌缺血、縮小梗死面積，對(duì)缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。有研究提示，人參可通過抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其保護(hù)作用［6］。細(xì)胞凋亡發(fā)生的途徑有多種，包括細(xì)胞外途徑，線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。多種蛋白分子Fas，bcl-2，Bax，CHOP 等參與其中［7］。但是此益氣活血方抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。

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