地黃飲子加減方對MCAO 模型大鼠血清HPA軸及其腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)研究

唐璐 孫塑倫 高穎 朱陵群

地黃飲子原方出自劉完素《宣明論方》:“治喑痱，腎虛弱厥逆，語聲不出，足軟不用”，作為滋腎陰、補腎陽、化痰開竅的代表方劑，它被廣泛運用于腦血管病、癡呆、神經(jīng)系統(tǒng)變性病等的臨床治療。本實驗通過觀察地黃飲子加減方對大腦中動脈線栓(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠血清HPA 軸激素水平及其腦細(xì)胞凋亡表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)，探討了缺血性中風(fēng)急性期應(yīng)用溫陽補腎法對促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，改善預(yù)后轉(zhuǎn)歸的作用機理。

1 材料與方法

1．1 動物及分組

成年SD 雄性大鼠30 只(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司SPF/VAF 級，合格證號:SCXK(京)2006－0009)。體重(280±10)g。動物稱重編號，用隨機數(shù)字表法［1］分為正常組、模型組、地黃飲子組，每組10 只。

1．2 MCAO 模型制備

模型組與地黃飲子組大鼠以大腦中動脈線栓法造模。以10%水合氯醛(0．35 mg·kg－1)將大鼠麻醉后仰臥固定，常規(guī)備皮，沿頸部正中線切開皮膚1．5 cm 左右，鈍性分離頸部肌群，以開瞼器充分暴露手術(shù)野，分離左側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)及 頸 外 動 脈(external carotid artery，ECA)，結(jié)扎ECA 及CCA 近心端，CCA 遠(yuǎn)心端穿線備用。動脈夾夾閉ECA 分叉處。于CCA 剪開一個小口，插入頭端直徑為0．28 mm 的栓線。輕輕結(jié)扎固定栓線于CCA 內(nèi)，開放動脈夾，將栓線插入頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，使其頭端到達(dá)大腦中動脈起始處。扎緊固定線，縫合皮膚。術(shù)中用100 W 燈泡照射，嚴(yán)格控制室溫。縫合傷口，清理血跡，將術(shù)后大鼠置于電熱毯保持體溫，直至蘇醒。

1．3 藥物制備及灌胃方法

地黃飲子加減方配伍及劑量:熟附片4 g、巴戟天10 g、山萸肉10 g、熟地12 g、石斛10 g、肉蓯蓉12 g、五味子6 g、麥冬15 g。按人與動物體型系數(shù)折算，等效比例為7，總生藥量316 g。將所有藥物用10 倍量和8 倍量的水煎煮2 次，每次1 小時，合并水煎液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，制成含生藥1．0 g·ml－1的藥液備用，pH 值7．0。每日稱重，按1 ml/100 g 的量連續(xù)灌胃7 天，其中地黃飲子組灌胃中藥藥液，模型組和正常組灌胃等量的生理鹽水，于最后一次灌胃后1 小時取材。至取材時模型組大鼠死亡2 只，原因為術(shù)后腹腔感染、灌胃失誤，剩余8 只;地黃飲子組大鼠死亡1 只，原因為灌胃失誤，剩余9 只。

1．4 主要試劑

促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)放射免疫試劑盒;促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)放射免疫試劑盒;皮質(zhì)醇(cortisol，COR)放射免疫試劑盒:由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供。細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(TUNEL):美國羅氏公司進(jìn)口分裝。DAB 顯色試劑盒:北京中杉金橋生物有限公司。

1．5 指標(biāo)檢測

1．5．1 血清下丘腦—垂體—腎上腺軸(hypothalamopituitary-adrenal axis，HPA)軸 大鼠麻醉后經(jīng)腹主動脈取血4 ml，注入含30 μl EDTA、40 μl 抑肽酶的試管中靜置，4 ℃3000 轉(zhuǎn)/分離心15 分鐘，取上清存－80 ℃冰箱備用。通過上海核所日環(huán)光電儀器有限公司Sn-695B 型免疫計數(shù)器測定放射強度，記錄數(shù)值結(jié)果。

1．5．2 細(xì)胞凋亡表達(dá)(TUNEL 免疫組化法)TUNEL 免疫組化法檢測細(xì)胞凋亡表達(dá)，陽性細(xì)胞為細(xì)胞核著棕黃色，陰性為細(xì)胞核著藍(lán)色。通過安裝在OlympusBX60 顯微鏡上的SPO-Ⅱ數(shù)碼成相軟件系統(tǒng)以及Metamorph 圖像分析軟件對TUNEL 免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行拍照分析。以統(tǒng)一的灰度值閾值作為度量標(biāo)準(zhǔn)界定陽性染色部位，采用陽性面積作為測量指標(biāo)，每只大鼠選5 張切片，在20×10，40×10 的倍數(shù)下，于腦梗死中心區(qū)，梗死周邊區(qū)，對側(cè)正常區(qū)隨機選取5 個視野進(jìn)行拍照、測量，測定陽性信號平均光密度值，讀取數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 地黃飲子加減方對MCAO 模型大鼠血清HPA軸的干預(yù)作用

正常組、地黃飲子組、模型組的ACTH、CRH、COR 各組數(shù)據(jù)經(jīng)K-S 檢驗提示均符合正態(tài)分布，各組數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA 方差分析提示總體有差異，以LSD法進(jìn)行多組間比較，結(jié)果如表1 所示，在腦缺血發(fā)生后7 天，模型組的ACTH、CRH 含量均明顯低于正常組，COR 含量明顯高于正常組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義;地黃飲子組的COR 明顯低于正常組、模型組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義;地黃飲子組ACTH、CRH 含量均明顯高于模型組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義;ACTH、CRH 含量略低于正常組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組大鼠灌胃7 天后血漿HPA 軸含量變化

2．2 地黃飲子對MCAO 大鼠缺血后腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)

如圖1 ～3 所示，模型組、地黃飲子組梗死側(cè)大腦皮層區(qū)均可見凋亡陽性細(xì)胞表達(dá)，胞核呈棕褐色，胞體縮小，染色不均，多集中于核膜下，可見核固縮和核碎裂。與模型組比較，經(jīng)地黃飲子加減方灌胃的大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)明顯減少。

圖1 正常組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)(TUNEL 染色，×400)

圖2 模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)

圖3 地黃飲子組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)(TUNEL 染色，×400)

正常組、地黃飲子組、模型組的腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)K-S 檢驗提示均符合正態(tài)分布，各組數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA 方差分析提示總體有差異，以LSD法進(jìn)行多組間比較，結(jié)果如表2 所示，正常組為陰性，模型組、地黃飲子組腦組織與正常組相比均可見細(xì)胞凋亡表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);模型組腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)較地黃飲子組明顯，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．01)。

表2 地黃飲子對MCAO 模型大鼠缺血后腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)()

表2 地黃飲子對MCAO 模型大鼠缺血后腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)()

注:與正常組比較aP ＜0．05;與正常組比較bP ＜0．01;與模型組比較cP ＜0．05;與模型組比較dP ＜0．01;

分組 n 腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)95%CI正常組 10 0．00±0．00 (0．00，0．00)模型組 8 0．35±0．03ab (0．33，0．38)地黃飲子組 9 0．24±0．04abcd (0．22，0．27)

2．3 MCAO 大鼠缺血后血清HPA 軸與腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的相關(guān)性分析

地黃飲子組、模型組的腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)各組數(shù)據(jù)經(jīng)K-S 檢驗提示均符合正態(tài)分布，以雙變量相關(guān)分析MCAO 大鼠血清HPA 軸含量與腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的相關(guān)性，如表3 所示，模型組血清ACTH 含量與腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，但CRH、COR 則與凋亡表達(dá)無明顯相關(guān)性，地黃飲子組血清ACTH、CRH、COR 含量與腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)均無明顯相關(guān)性。

3 討論

根據(jù)本實驗結(jié)果，地黃飲子能夠改善腦缺血大鼠HPA 軸的紊亂狀態(tài)，通過提高CRH 含量抑制了大鼠體內(nèi)COR 的釋放。這一結(jié)果支持了鐘歷勇、沈自尹等［2］提出的補腎藥可通過上調(diào)下丘腦CRF mRNA 表達(dá)來保護(hù)HPA 軸免受外源性皮質(zhì)醇的抑制，補腎藥對腎陽虛證的主要調(diào)節(jié)點定位于下丘腦的觀點。

表3 模型組、地黃飲子組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)與HPA 軸含量的相關(guān)性分析

模型組、中藥組的梗死側(cè)大腦皮層區(qū)域均可見有凋亡陽性細(xì)胞的表達(dá)，經(jīng)地黃飲子加減方灌胃的中藥組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)明顯減少。說明地黃飲子可明顯抑制腦組織細(xì)胞凋亡的表達(dá)。王利軍［3］曾通過實驗證實，地黃飲子可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子BDNF 及凋亡相關(guān)基因Bcl-2 和BAX 的表達(dá)來發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、對抗腦缺血的作用。另有實驗證實，加減地黃飲子可顯著提高缺血腦組織內(nèi)相關(guān)酶的活性，通過抗自由基損傷來實現(xiàn)對凋亡表達(dá)的抑制。腦組織缺血缺氧后的損傷機制較為復(fù)雜，抗損傷的途徑也并不唯一，需進(jìn)一步研究。

模型組ACTH 含量與腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，CRH、COR 與凋亡表達(dá)無明顯相關(guān)性，說明模型組血清ACTH 含量低于中藥組，細(xì)胞凋亡表達(dá)較之更為明顯，而其余指標(biāo)之間無明顯相關(guān)性的原因可能與樣本量偏少有一定的關(guān)系。提示地黃飲子加減方抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用的功效可能是通過改善HPA 軸的紊亂狀態(tài)這一機制來實現(xiàn)的。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，腎陽虛證與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)(NEIS)有關(guān)，腎陽虛證在下丘腦—垂體—靶腺(腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、性腺和胸腺)軸不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂，且主要發(fā)病環(huán)節(jié)在下丘腦(或更高級)的調(diào)節(jié)功能紊亂［4］。HPA 軸在機體接受應(yīng)激刺激后被激活，參與調(diào)控機體對應(yīng)激的急性反應(yīng)，介導(dǎo)一系列的代謝和心血管的代償機制以克服應(yīng)激原對機體的威脅或?qū)?nèi)環(huán)境的擾亂作用，具有一定的積極意義。但過于劇烈的應(yīng)激反應(yīng)同時會促進(jìn)和加劇炎癥的發(fā)生，對免疫機制也有顯著的抑制效應(yīng)，通過NEIS 對機體產(chǎn)生應(yīng)激損傷。本實驗結(jié)果說明在腦缺血發(fā)生后早期使用中藥地黃飲子加減方，能夠穩(wěn)定下丘腦—垂體—腎上腺系統(tǒng)的功能狀態(tài)，使應(yīng)激刺激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生不至于過度劇烈，通過補腎的方法達(dá)到護(hù)腦的目的，在腦缺血急性期發(fā)揮了扶正的作用，對改善整體狀態(tài)，縮短急性期病程，改善預(yù)后，都具有重要的臨床參考價值。

中風(fēng)病的病位在腦，腦與腎密切相關(guān)。腎虛既是其發(fā)病基礎(chǔ)，又是病情發(fā)展過程中影響預(yù)后和病情輕重的關(guān)鍵因素。鑒于腎與腦的密切關(guān)系及腎虛在中風(fēng)病因病機中的重要作用，在治療時對急性期患者早期通過補腎的方法扶助正氣，對幫助患者腦功能的恢復(fù)，減輕腦功能損害具有重要的意義。

［1］ 苗明三．實驗動物和動物實驗技術(shù)［M］．北京:中國中醫(yī)藥出版社，1997:142．

［2］ Tsigos C，Chrousos GP．Physiology of the hypothalamic-pituitaryadrenal axis in health and dysregulation in psychiatric and autoimmune disorders［J］．Endocrinol Metab Clin North Am，1994，23(3):451-466．

［3］ 王利軍．地黃飲子對大鼠腦缺血后腦內(nèi)相關(guān)因子的影響［D］．北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2003．

［4］ 蔡定芳，沈自尹，陳曉紅，等．烏頭堿對大鼠下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素含量的影響［J］．中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16(9):544．