低蛋白水平飼料對(duì)黃鱔血清雌二醇和睪酮含量的影響

王淳懿，袁漢文，楊代勤 （長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025）

黃鱔 ［Monopterusalbus（Zuiew）］是一種雌性先熟雌雄同體魚類，第一次性成熟都為雌性，產(chǎn)卵后經(jīng)過間性最終逆轉(zhuǎn)為雄性，并且這一發(fā)育過程是單向的，即發(fā)生性轉(zhuǎn)變后不再由雄性個(gè)體逆轉(zhuǎn)為雌性個(gè)體；而且間性個(gè)體在較長的一段時(shí)間內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)［1］。黃鱔在自然條件下轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄孕埕~至少需要3a的時(shí)間，在自然條件下也發(fā)現(xiàn)有超過6齡以上的雌性個(gè)體［2］。自從發(fā)現(xiàn)黃鱔自然性逆轉(zhuǎn)特性以來，很多學(xué)者對(duì)其分別從生理生化［3］、細(xì)胞水平［4］和分子水平［5-6］等方面對(duì)其逆轉(zhuǎn)機(jī)制進(jìn)行了研究，但至今還沒弄清楚。宋平等［7］研究了黃鱔雌雄兩性中性類固醇激素的周年變化規(guī)律，到目前為止，關(guān)于低蛋白飼料對(duì)黃鱔血清性類固醇激素含量的影響報(bào)道很少。本研究通過探討低蛋白飼料對(duì)黃鱔血清中雌二醇和睪酮含量的影響，以為進(jìn)一步探索黃鱔性逆轉(zhuǎn)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)組，每組飼料的蛋白含量分別為100、150、200、250g／kg和400g／kg，飼料中各成分含量及營養(yǎng)水平見表1。所有飼料均以魚粉和大豆粉作為蛋白源，魚油作為脂肪源，α-淀粉作為能量來源；以其中飼料蛋白含量為400g／kg組作為對(duì)照［8］。飼料中各種原料經(jīng)過60目的篩子后充分混勻，魚油根據(jù)配比逐漸加入到飼料中，每千克飼料約加水400ml，經(jīng)過約30min的攪拌后，將飼料制成直徑為2．0mm的圓柱狀，在室溫下烘干，然后儲(chǔ)存在-20℃的冰箱中備用。

1．2 試驗(yàn)魚飼養(yǎng)與管理

整個(gè)養(yǎng)殖試驗(yàn)均在室外池塘的網(wǎng)箱中進(jìn)行。所用試驗(yàn)魚為同批孵化出來的苗種 （均由長江大學(xué)黃鱔研究所提供），分別投放到15個(gè)網(wǎng)箱中 （5個(gè)處理3個(gè)平行），每個(gè)試驗(yàn)網(wǎng)箱中投放50條，試驗(yàn)魚的初始體重為 （13．50±1．10）g，試驗(yàn)網(wǎng)箱的規(guī)格為2m×1m×1．5m。在試驗(yàn)網(wǎng)箱中經(jīng)過2周的馴養(yǎng)后開始進(jìn)行正式養(yǎng)殖試驗(yàn)，每個(gè)網(wǎng)箱中投喂對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)飼料。網(wǎng)箱中投放水花生作為黃鱔的棲息環(huán)境。

養(yǎng)殖試驗(yàn)從2011年5月到2012年7月共15個(gè)月。整個(gè)試驗(yàn)期間，每天18：00時(shí)投喂，投喂量為魚體重的2%～6%，第2天早晨將殘餌進(jìn)行清理。在水溫低于10℃或超過38℃時(shí)和遇到雷雨天氣則不進(jìn)行投喂。從養(yǎng)殖開始后的第4個(gè)月取樣，每個(gè)月月底取樣1次，取樣時(shí)每個(gè)網(wǎng)箱中隨機(jī)挑選3條，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

表1 試驗(yàn)飼料配方組成及營養(yǎng)水平

1．3 血清雌二醇和睪酮含量的測(cè)定

采用斷尾法采血。所取血樣盛放在事先用肝素鈉潤洗過的1．5ml的離心管中，采血500～3000μl，平均為 （1200±200）μl。血樣采取后放于離心機(jī)中以3500r／min離心25min，收集血清后存放在-20℃的冰箱中備用。

按照北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的雌二醇放射免疫分析試劑盒和北京科美東雅生物技術(shù)有限公司所生產(chǎn)的睪酮放射免疫分析試劑盒說明書的方法和步驟分別測(cè)定雌二醇和睪酮的含量，采用中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn)的Gc-911γ放射免疫計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。其中，雌二醇的可檢測(cè)范圍是0～4000pg／ml，睪酮的可檢測(cè)范圍是0～2000pg／ml。試劑盒主要技術(shù)參數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)范圍：5～4000pg／ml；靈敏度：≤2pg／ml；精密度：批內(nèi)CV＜10%，批間CV＜15%。

1．4 數(shù)據(jù)分析及處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15．0進(jìn)行方差分析、顯著性及相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （mean±SD）表示。以P＜0．05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2．1 飼料中不同蛋白水平對(duì)黃鱔血清雌二醇含量的影響

試驗(yàn)期間，黃鱔血清雌二醇含量的變化如圖1所示。由圖1可見，繁殖季節(jié)后，從8月份開始，各試驗(yàn)組中雌二醇的含量都呈下降趨勢(shì)，并且剛開始時(shí)下降的速率較快隨后減慢。雌二醇含量在第二年1月份達(dá)到最低值，越冬后雌二醇含量開始上升，在繁殖季節(jié)前迅速上升，在第二年5月份達(dá)到最大峰值，隨后開始下降。

圖1 不同月份不同飼料蛋白水平下的黃鱔血清雌二醇含量

2．2 不同蛋白水平對(duì)黃鱔血清睪酮含量的影響

試驗(yàn)期間，黃鱔血清睪酮含量的變化如圖2所示。有圖2可見，繁殖季節(jié)后，從8月份開始，各試驗(yàn)組中睪酮的含量呈下降趨勢(shì)，剛開始時(shí)下降的速率較快隨后減慢。在越冬季節(jié)睪酮含量達(dá)到最低值，并且12月和第二年1月份血清中睪酮的含量都檢測(cè)不到，越冬后睪酮含量開始上升，在繁殖季節(jié)前上升迅速，在第二年6月份達(dá)到最大峰值，隨后迅速下降。

圖2 不同月份不同飼料蛋白水平下的黃鱔血清睪酮含量

不同蛋白水平的飼料對(duì)黃鱔血清雌二醇和睪酮都有顯著的影響 （表2）。對(duì)照組中黃鱔血清雌二醇含量顯著性地高于其他各試驗(yàn)組，而投喂蛋白含量為100、150g／kg 和 200g／kg 的 3 組 與150、200g／kg和250g／kg的3組間血清雌二醇均沒有顯著性差異；對(duì)照組中睪酮含量顯著性低于各處理組，蛋白含量為100g／kg組的睪酮含量顯著性地高 于 200、250g／kg 和 400g／kg 處 理組，但是蛋白含量為200g／kg和250g／kg的2組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 不同蛋白水平對(duì)雌二醇和睪酮含量的方差分析

2．3 不同蛋白水平和月份交互作用對(duì)黃鱔血清雌二醇和睪酮含量的影響

鑒于黃鱔雌二醇和睪酮具有季節(jié)性差異，本研究對(duì)不同蛋白水平和不同月份的對(duì)黃鱔血清雌二醇和睪酮的交互作用進(jìn)行了分析 （表3）。結(jié)果表明，不同蛋白水平對(duì)雌二醇和睪酮含量都有顯著性影響。不同蛋白水平、不同月份和兩者的交互作用，三者均對(duì)黃鱔血清雌二醇和睪酮含量的影響均呈顯著性。

表3 蛋白含量和月份交互作用對(duì)黃鱔血清雌二醇和睪酮含量的影響分析

3 討論

本研究結(jié)果表明，黃鱔血清雌二醇和睪酮含量在繁殖周期內(nèi)有著相似的變化規(guī)律。繁殖季節(jié)后，各試驗(yàn)組中雌二醇和睪酮的含量都呈下降趨勢(shì)，并且剛開始時(shí)下降的速率較快隨后減慢，并在越冬期間達(dá)到低谷；越冬期之后，兩者含量開始上升，在繁殖季節(jié)達(dá)到高峰，這與宋平等［7］報(bào)道的結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，飼料的蛋白水平影響黃鱔血清雌二醇和睪酮的含量，雌二醇含量隨著飼料中蛋白水平的升高而升高，而睪酮的含量則隨著蛋白含量的升高而降低。

性類固醇激素在魚類的性別分化過程中起著十分重要和特殊的作用。很多關(guān)于性類固醇激素調(diào)節(jié)硬骨魚的配子生成的研究表明，卵巢產(chǎn)生的雌激素主要調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長發(fā)育，而精巢產(chǎn)生的雄激素主要調(diào)節(jié)精子發(fā)生［9］。睪酮是11-氧睪酮和雌二醇的前體，在性別分化過程中起著十分重要的作用，也可以反映性別分化的過程；雌二醇被認(rèn)為是雌魚中重要的性類固醇激素，在脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育特別是性別分化過程中起著十分重要的作用［10-11］。雌二醇還被認(rèn)為是控制性腺發(fā)育生理過程和誘導(dǎo)卵黃蛋白質(zhì)合成的物質(zhì)［12］。

本研究結(jié)果表明，黃鱔血清雌二醇含量隨著蛋白質(zhì)水平的升高而增加，而睪酮含量則降低；二者在繁殖季節(jié)前和繁殖期都快速升高。這意味著類固醇激素作為內(nèi)源性物質(zhì)在配子發(fā)生過程中起著重要作用，類固醇激素在配子形成時(shí)瞬間升高反映了類固醇激素作為內(nèi)源性調(diào)節(jié)物質(zhì)在繁殖過程中起著重要的作用。Bogart［13］認(rèn)為性別分化是由雄性激素和雌性激素的比例決定的，這個(gè)比例高則發(fā)展為雄性，反之則發(fā)展為雌性。性別分化在其他一些物種中也與這個(gè)比例有關(guān)［14］。

［1］Liem K F．Geographical and taxonomic variation in the pattern of natural sex reversal in the teloest fish order Synbranchiformes［J］．Journal of Zoology，1968，156：225-238．

［2］楊代勤，陳 芳，阮國良，等．黃鱔性轉(zhuǎn)變與體重、年齡的關(guān)系 ［J］．長江大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版）農(nóng)學(xué)卷，2008，5（4）：45-47．

［3］Tao Y X，Lin H R，Kraak G V D，et al．Hormonal induction of precocious sex reversal in the ricefield eel，Monopterusalbus［J］．Aquaculture，1993，118：131-140．

［4］肖亞梅，劉 筠．黃鱔由間性發(fā)育轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌园l(fā)育的細(xì)胞生物學(xué)研究 ［J］．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1995，19（4）：297-304．

［5］Huang X，Guo Y Q，Shui Y，et al．Multiple alternative splicing and differential expression ofdmrt1during gonad transformation of the rice field eel［J］．Biology of Reproduction，2005，73：1017-1024．

［6］Song H J，Zhou F，Xia L X，et al．Construction of a BAC library and identification ofDmrt1gene of the rice field eel，Monopterusalbus［J］．Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，348：775-780．

［7］宋 平，熊全沫．黃鱔血清睪酮和雌二醇含量周年變化規(guī)律的研究 ［J］．武漢大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版），1993，（2）：115-119．

［8］楊代勤．黃鱔營養(yǎng)需要與消化酶的研究 ［D］．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002．

［9］Nagahama Y．17α，20β-Dihydroxy-4-pregnen-3-one，a maturation-inducing hormone in fish oocytes：Mechanisms of synthesis and action ［J］．Steriods，1997，62：190-196．

［10］Chang C F，Hung C Y，Chiang M C，et al．The concentrations of plasma sex steroids and gonadal aromatase during controlled sex differentiation in grey mullet，Mugilcephalus［J］．Aquaculture，1999，177，37-45．

［11］Piferrer F．Endocrine sex control strategies for the feminization of teleost fish［J］．Aquaculture，2001，197 （1-4）：229-281．

［12］Blaise C，GagnéF，Pellerin J，et al．Determination of vitellogenin-like properties inMyaarenariahemolymph（Saguenay Fjord，Canada）：apotential biomarker for endocrine disruption ［J］．Environmental toxicology，1999，14：455-465．

［13］Bogart M H．Sex determination：A hypothesis based on steroid ratios［J］．Journal of Theoretical Biology，1987，128：349-357．

［14］Rougeot C，Krim A，Mandiki S N M，et al．Sex steroid dynamics during embryogenesis and sexual differentiation inEurasian perch，Percafluviatilis［J］．Theriogenology，2007，67：1046-1052．Eel，Monopterusalbus（Zuiew）