小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

任　琳，　李　軼，　王山梅，　師　娟，　郭　思

(河南省人民醫(yī)院感染控制科，細(xì)菌室，河南 鄭州 450000)

結(jié)核分枝桿菌是一種典型的胞內(nèi)致病菌，可以通過多種不同的機(jī)制逃逸機(jī)體免疫細(xì)胞的殺傷及清除，從而在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和繁殖，并長期存活于機(jī)體內(nèi)。有證據(jù)顯示宿主可以通過誘導(dǎo)受感染巨噬細(xì)胞的凋亡來抑制胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的生長[1-2]。進(jìn)一步的研究表明分枝桿菌毒力株抑制受感染巨噬細(xì)胞凋亡的能力要強(qiáng)于分枝桿菌減毒株[3-4]。 比較基因組學(xué)分析揭示了結(jié)核分枝桿菌中的差異區(qū)段1(region of difference 1, RD1)在所有的卡介苗菌株(bacillus Calmette-Guerin,BCG)中是缺失的。相反，RD1存在于結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌毒力株中[5]。其中，培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein 10, CFP10)和早期分泌性抗原靶6(early secretory antigenic target 6, ESAT6)是由RD1區(qū)的Rv3874和Rv3875兩個(gè)基因分別編碼的分泌性蛋白，研究發(fā)現(xiàn)CFP10和ESAT6對(duì)結(jié)核分枝桿菌的毒力起著重要的作用。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)把CFP10和ESAT6重組到BCG中能使BCG的毒力和免疫性增強(qiáng)[6-8],但其對(duì)宿主巨噬細(xì)胞凋亡的影響以及相應(yīng)的毒力機(jī)制并未完全闡述清楚。本研究從結(jié)核分枝桿菌H37RV株中克隆CFP10-ESAT6基因，將其重組于真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1中，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到RAW264.7巨噬細(xì)胞中，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CFP10-ESAT6對(duì)巨噬細(xì)胞毒性以及凋亡的影響，探討CFP10-ESAT6融合蛋白在結(jié)核分枝桿菌毒力中所起到的作用及其可能機(jī)制。

材　料　和　方　法

1材料

1.1基因組、質(zhì)粒和細(xì)胞結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA由河南省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1購自Clontech。RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株，由鄭州大學(xué)病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2主要試劑質(zhì)粒提取試劑盒和PCR清潔回收試劑盒(Omega)；PCR試劑盒、DNA連接試劑盒和DNA marker (TaKaRa)；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ (Fermentas)；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒(BestBio)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen)；十字孢堿、氨芐青霉素和新霉素(Merck)；鼠抗GFP單克隆抗體(Sigma)；羊抗鼠IgG-HRP(Santa Cruz)；FITC標(biāo)記抗小鼠Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)(Biolegend)；結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白由河南省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

2方法

2.1CFP10/ESAT6融合基因PCR擴(kuò)增及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank中結(jié)核分枝桿菌H37Rv株CFP10和ESAT6基因序列設(shè)計(jì)引物。上游和下游引物分別引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。CFP10基因上游引物P1： 5’-GC AAGCTT ATG GCA GAG ATG AAG ACC-3’；CFP10基因下游引物P2：5’-GCT GCC GCC ACC GCC GGA TCC GCC ACC GCC GCT TCC ACC GCC ACC GAA GCC CAT TTG CGA GGA C-3’;ESAT6基因上游引物P3：5’-GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA TCC GGC GGT GGC GGC AGC ATG ACA GAG CAG CAG TGG AAT - 3’;ESAT6基因下游引物P4：5’TA GAATTC CTA TGC GAA CAT CCC AGT G- 3’(劃線部分分別是HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，引物由Invitrogen合成)。以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株全基因組DNA為模板，分別以引物P1/P2和P3/P4進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，獲得下游帶有中間接頭序列的CFP10基因和上游帶有中間接頭序列的ESAT6基因。PCR擴(kuò)增體系為：H2O 32.5 μL，5×PrimeSTAR? Buffer(Mg2+plus)10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，引物P1/P2或P3/P4(20 μmol/L)各1μL，結(jié)核分枝桿菌基因組DNA 1 μL，PrimeSTAR?HS 0.5 μL。反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性4 min，98 ℃ 變性10 s，60 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸2 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。然后再以CFP10和ESAT6基因PCR產(chǎn)物為模板，以引物P1/P4進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，獲得由中間接頭序列連接的CFP10-ESAT6融合基因。PCR擴(kuò)增體系為：H2O 31.5 μL，5×PrimeSTAR? Buffer(Mg2+plus)10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，引物P1/P4(20 μmol/L)各1 μL，CFP10和ESAT6基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各1 μL，PrimeSTAR? HS 0.5 μL，總體積為50μL。CFP10-ESAT6融合基因與質(zhì)粒pEGFP-N1分別用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切，純化。CFP10-ESAT6融合基因與pEGFP-N1質(zhì)粒以摩爾比10∶1比例混合，用DNA連接試劑進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鋪板過夜培養(yǎng)，隨即挑取轉(zhuǎn)化菌落于LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，做雙酶切和PCR鑒定，以上鑒定正確的陽性克隆送大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2.2重組質(zhì)粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6的轉(zhuǎn)染及鑒定使用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6轉(zhuǎn)染RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞，以構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CFP10-ESAT6的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系。將RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞傳代至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞生長處于90%的匯合率時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用無菌EP管中制備溶液1：取脂質(zhì)體10 μL加入到240 μL無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)基中；溶液2：取4 μg重組質(zhì)粒，加入到無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液250 μL。將溶液1與溶液2混合，在室溫下孵育20 min。用無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液洗6孔板2次，加入2 mL無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液，將重組質(zhì)粒/脂質(zhì)體混合液加入培養(yǎng)孔內(nèi)，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，設(shè)重組質(zhì)粒/脂質(zhì)體組和空白對(duì)照組。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換含有血清的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，去掉培養(yǎng)基，用PBS洗板1次，加入按最佳篩選濃度配制的新霉素(G418)篩選培養(yǎng)基。篩選14 d后，可見有抗性的克隆生長，停藥培養(yǎng)，挑選單克隆，Western blotting鑒定CFP10-ESAT6融合蛋白的表達(dá)。

2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CFP10-ESAT6融合蛋白表達(dá)水平的鑒定收集經(jīng)過G418篩選的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞，常規(guī)提取總蛋白，BCA比色法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，依次加入Ⅰ抗(抗GFP抗體)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，Ⅱ抗(HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG)室溫孵育2 h，TBST洗膜，暗室加入ECL液孵育5 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察CFP10-ESAT6融合蛋白的表達(dá)情況。

2.4細(xì)胞增殖活性檢測(cè)設(shè)空白對(duì)照組、pEGFP-N1組和pEGFP-N1/CFP10-ESAT6組，每組各5孔，每孔按細(xì)胞數(shù)5×103接種于96孔板，然后分別于12、24、48和72 h在每孔中各加入20 μL MTT液，培養(yǎng)4 h，棄去上清，再加入200 μL DMSO，充分振蕩10 min。最后分別檢測(cè)3組各時(shí)點(diǎn)的吸光度(A490)并重復(fù)3次。

2.5Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡設(shè)空白對(duì)照組、pEGFP-N1組和pEGFP-N1/CFP10-ESAT6組，將各組細(xì)胞接種至6孔板中(1×106cells/well)，培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞，用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，然后用400 μL 1×binding buffer 懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×109cells/L，在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育15 min，最后加入10 μL PI后輕輕混勻于2～8 ℃避光條件下孵育5 min。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。使用十字孢堿和結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白，終濃度分別為1 μmol/L和10 mg/L作用于3組細(xì)胞，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h，然后按照Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染凋亡法檢測(cè)樣本各時(shí)點(diǎn)的凋亡情況。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞表面TLR2的表達(dá) 收集上述各組細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，然后用200 μL PBS重懸，重復(fù)洗3次，加入FITC標(biāo)記的抗鼠TLR2Ⅰ抗(1∶1 000)在4 ℃孵育30 min，用PBS洗2次，再用PBS重懸細(xì)胞密度為106cells∶300 μL, 然后上流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，CellQuest軟件分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合基因PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株全基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增出約650 bp左右的特異性片段，與預(yù)期的大小一致。限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒顯示該重組質(zhì)粒含有約650 bp片段。測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中CFP10和ESAT6基因完全匹配，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1。

Figure 1. PCR products ofCFP10-ESAT6 gene and analysis of recombinant plasmid pEGFP-N1/CFP10-ESAT6. M: DNA marker； 1: PCR product ofCFP10-ESAT6 gene inMycobacteriumtuberculosis; 2: recombinant pEGFP-N1/CFP10-ESAT6; 3: recombinant pEGFP-N1/CFP10-ESAT6 digested withHindⅢ andEcoR Ⅰ.

圖1PCR擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合基因及重組質(zhì)粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6的鑒定

2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞中CFP10-ESAT6的表達(dá)

使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞中，以構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CFP10-ESAT6的小鼠巨噬細(xì)胞系。用新霉素篩選轉(zhuǎn)染的小鼠巨噬細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法單克隆化，連續(xù)傳代培養(yǎng)后，分別選取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和pEGFP-N1/ CFP10-ESAT6的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞呈綠色熒光，傳代10次以上，EGFP仍有80%的陽性率，這些陽性細(xì)胞被認(rèn)為可以穩(wěn)定表達(dá)目的基因。免疫印跡分析表明，含重組質(zhì)粒的細(xì)胞在約43 kD處出現(xiàn)明顯條帶，空質(zhì)粒細(xì)胞蛋白在27 kD處出現(xiàn)條帶，見圖2。

Figure 2. Expression of CFP10-ESAT6-EGFP recombinant protein in stable transfected RAW264.7 mouse macrophages. 1: pEGFP-N1 transfected cells; 2: normal cells; 3: pEGFP-N1/CFP10-ESAT6 transfected cells.

圖2CFP10-ESAT6-EGFP重組蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

3細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CFP10-ESAT6融合蛋白對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞增殖活性的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果表明，與空質(zhì)粒組和空白對(duì)照相比，重組質(zhì)粒細(xì)胞在不同時(shí)點(diǎn)吸光度并沒有明顯變化，見圖3。這一結(jié)果表明在RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CFP10-ESAT6融合蛋白對(duì)細(xì)胞并沒有毒性作用。

Figure 3. Viability of macrophages transfected with CFP10-ESAT6 assessed by MTT. Mean±SD.n=3.

圖3MTT法檢測(cè)CFP10-ESAT6轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞的增殖活性

4細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CFP10-ESAT6融合蛋白對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞抗凋亡的影響

為了檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CFP10-ESAT6融合蛋白是否能夠抑制巨噬細(xì)胞的凋亡，本實(shí)驗(yàn)使用結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白和十字孢堿分別作用于空白對(duì)照細(xì)胞、空質(zhì)粒細(xì)胞和重組細(xì)胞。當(dāng)使用結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白作用于細(xì)胞時(shí)，結(jié)果顯示重組細(xì)胞的凋亡率要小于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組，十字孢堿作用于細(xì)胞72 h，3組細(xì)胞的凋亡率隨著時(shí)間的延長而增加，與空白對(duì)照細(xì)胞和空質(zhì)粒細(xì)胞相比，重組細(xì)胞的凋亡率變化并沒有顯著差異，見圖4、5。這一結(jié)果表明胞內(nèi)表達(dá)的CFP10-ESAT6融合蛋白并不能抑制十字孢堿所造成的細(xì)胞凋亡，但能夠抑制結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。

Figure 4. Effect ofMycobacteriumtuberculosis19 kD lipoprotein on the apoptosis of macrophages transfected with CFP10-ESAT6. Mean±SD.n=3.*P< 0.05vsnormal.

圖4結(jié)核分枝桿菌19kD脂蛋白對(duì)轉(zhuǎn)染CFP10-ESAT6巨噬細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. Effect of staurosporine on the apoptosis of macrophages transfected with CFP10-ESAT6.Mean±SD.n=3.

圖5十字孢堿對(duì)轉(zhuǎn)染CFP10-ESAT6巨噬細(xì)胞凋亡的影響

5細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CFP10-ESAT6融合蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞TLR2表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)CFP10-ESAT6融合蛋白是否能調(diào)控結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白受體TLR2的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了pEGFP-N1/CFP10-ESAT6細(xì)胞組在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，重組質(zhì)粒細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度明顯低于空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)，見圖6。

Figure 6. Effect ofMycobacteriumtuberculosis19 kD lipoprotein on TLR2 expression in macrophages transfected with CFP10-ESAT6. The TLR2 expression of macrophages transfected with CFP10-ESAT6 decreased in a time-dependent manner. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal.

圖6結(jié)核分枝桿菌19kD脂蛋白對(duì)轉(zhuǎn)染CFP10-ESAT6巨噬細(xì)胞TLR2表達(dá)的影響

討　　論

結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，感染巨噬細(xì)胞后，結(jié)核分枝桿菌能在受感染的宿主細(xì)胞中增殖和存活。機(jī)體在遭遇到病原微生物感染后誘導(dǎo)受感染細(xì)胞死亡或凋亡是宿主先天性免疫反應(yīng)的一部分[9]，受感染細(xì)胞的死亡是機(jī)體的一個(gè)重要防御機(jī)制，這種機(jī)制有利于保護(hù)其它未受感染的細(xì)胞。有研究報(bào)道稱宿主巨噬細(xì)胞的凋亡能夠減少分枝桿菌的生存能力，是機(jī)體抗結(jié)核菌胞內(nèi)感染中先天性免疫反應(yīng)中的一部分[10-12]。另一方面，有若干研究證實(shí)了結(jié)核分枝桿菌毒力株能夠抑制宿主巨噬細(xì)胞的凋亡?？傊?，結(jié)核分枝桿菌和宿主巨噬細(xì)胞間的相互作用是結(jié)核發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素，宿主試圖感知細(xì)胞內(nèi)的病原體并誘導(dǎo)感染細(xì)胞死亡而病原體則隱藏在宿主細(xì)胞內(nèi)抑制其死亡。

有研究表明分枝桿菌減毒株(BCG, H37Ra)所造成的巨噬細(xì)胞凋亡率要明顯高于分枝桿菌毒力株(Mtb-H37Rv,M.bovis)[13]。由于細(xì)胞的死亡能夠減弱分枝桿菌的生存能力，所以結(jié)核分枝桿菌抑制巨噬細(xì)胞凋亡的能力被認(rèn)為是結(jié)核菌的一個(gè)致病毒力因素?；蚪M學(xué)分析揭示了結(jié)核分枝桿菌RD1在BCG中是缺失的，相反，RD1基因片段存在于結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌毒力株中。RD1基因區(qū)段中的CFP10和ESAT6基因作為結(jié)核分枝桿菌的重要分泌性抗原，與分枝桿菌的毒力和免疫性密切相關(guān)。因此CFP10和ESAT6在結(jié)核分枝桿菌和巨噬細(xì)胞相互作用的過程中是否具有毒性以及在凋亡中所起到的作用是個(gè)值得探討的重要問題。

本研究通過構(gòu)建pEGFP-N1/CFP10-ESAT6真核表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光的表達(dá)，免疫印跡分析顯示CFP10-ESAT6融合基因得以表達(dá)，表明構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞成功。本實(shí)驗(yàn)通過MTT和流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CFP10-ESAT6融合蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞增殖以及凋亡的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，以不同時(shí)點(diǎn)檢測(cè)重組質(zhì)粒巨噬細(xì)胞的增殖情況，其MTT吸光度和空白質(zhì)粒組、空白對(duì)照組相比并沒有明顯變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CFP10-ESAT6融合蛋白沒有造成宿主巨噬細(xì)胞的損傷和死亡，其本身不具有細(xì)胞毒作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了胞內(nèi)表達(dá)CFP10-ESAT6是否能夠抑制巨噬細(xì)胞的凋亡，使用結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白和非受體依賴的線粒體途徑凋亡誘導(dǎo)劑十字孢堿處理上述各組細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長十字孢堿處理的各組細(xì)胞，其凋亡率都在增加，而且重組質(zhì)粒細(xì)胞組和其它2組細(xì)胞相比凋亡率并沒有明顯差異。用結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白處理上述各組細(xì)胞，細(xì)胞同樣隨著時(shí)間的延長凋亡率在增加，但在24、48和72 h時(shí)點(diǎn)，pEGFP-N1/CFP10-ESAT6細(xì)胞組的凋亡率要低于其它2組并有明顯差異。上述結(jié)果表明胞內(nèi)表達(dá)的CFP10-ESAT6不能改變十字孢堿所造成的凋亡，但可以抑制結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。目前所知有兩種途徑可以導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡：通過Fas等死亡受體與相應(yīng)配體結(jié)合所介導(dǎo)的細(xì)胞外途徑和促凋亡/抗凋亡蛋白所控制所介導(dǎo)的線粒體途徑 。本實(shí)驗(yàn)用的2種凋亡誘導(dǎo)劑，十字孢堿是蛋白激酶C抑制劑，能夠通過胞內(nèi)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白是巨噬細(xì)胞TLR2的配體，同樣能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡[14-15]。上述結(jié)果提示了結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白在巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)能夠通過細(xì)胞外受體途徑保護(hù)巨噬細(xì)胞免受凋亡，而不是線粒體途徑。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了重組質(zhì)粒細(xì)胞TLR2的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了重組質(zhì)粒細(xì)胞TLR2的表達(dá)水平要低于空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組，差異顯著并且其TLR2受體表達(dá)水平的下降具有時(shí)間依賴性。以上結(jié)果表明巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CFP10-ESAT6融合蛋白能夠抑制結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡，這一作用是通過下調(diào)巨噬細(xì)胞表面TLR2受體來實(shí)現(xiàn)的。

總之，本研究探討了細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CFP10-ESAT6融合蛋白對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的毒性作用，該結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白本身不會(huì)改變巨噬細(xì)胞的活性，但該分泌性融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)能夠下調(diào)TLR2的表達(dá)，進(jìn)而抑制了結(jié)核分枝桿菌19 kD脂蛋白所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，結(jié)果提示了作為早期分泌性抗原，該融合蛋白可能通過細(xì)胞外受體途徑抑制宿主細(xì)胞的凋亡從而有助于胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存活和增殖。由于在結(jié)核病人體內(nèi)宿主巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的，所以我們需要進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白CFP10-ESAT6在體內(nèi)對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響，以便于透徹地掌握結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Riendeau CJ, Kornfeld H. THP-1 cell apoptosis in response to mycobacterial infection [J]. Infect Immun, 2003, 71(1): 254-259.

[2]Sly LM, Hingley-Wilson SM, Reiner NE, et al. Survival ofMycobacteriumtuberculosisin host macrophages involves resistance to apoptosis dependent upon induction of antiapoptotic Bcl-2 family member Mcl-1[J]. J Immunol, 2003, 170(1): 430-437.

[3]Dhiman R, Raje M, Majumdar S. Differential expression of NF-κB in mycobacteria infected THP-1 affects apoptosis [J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1770(4): 649-658.

[4]Zhang J, Jiang R, Takayama H, et al. Survival of virulentMycobacteriumtuberculosisinvolves preventing apoptosis induced by Bcl-2 upregulation and release resulting from necrosis in J774 macrophages [J]. Microbiol Immunol, 2005, 49(9): 845-852.

[5]Behr MA, Wilson MA, Gill WP, et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray [J]. Science, 1999, 284(5419):1520-1523.

[6]Pym AS, Brodin P, Brosch R, et al. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccinesMycobacteriumbovisBCG andMycobacteriummicroti[J]. Mol Microbiol, 2002, 46(3): 709-717.

[7]Lewis KN, Liao R, Guinn KM, et al. Deletion of RD1 fromMycobacteriumtuberculosismimics bacilli Calmette-Guérin attenuation [J]. J Infect Dis, 2003, 187(1): 117-123.

[8]Pym AS, Brodin P, Majlessi L, et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis [J]. Nat Med, 2003, 9(5): 533-539.

[9]Iriti M, Faoro F. Review of innate and specific immunity in plants and animals [J]. Mycopathologia, 2007, 164(2): 57-64.

[10] Molloy A, Laochumroonvorapong P, Kaplan G. Apoptosis, but not necrosis, of infected monocytes is coupled with killing of intracellular bacillus Calmette-Guerin [J]. J Exp Med, 1994, 180(4): 1499-1509.

[11] Fratazzi C, Arbeit RD, Carini C, et al. Programmed cell death ofMycobacteriumaviumserovar 4-infected human macrophages prevents the mycobacteria from spreading and induces mycobacterial growth inhibition by freshly added, uninfected macrophages [J]. J Immunol, 1997, 158(9): 4320-4327.

[12] Keane J, Shurtleff B, Kornfeld H. TNF-dependent BALB/c murine macrophage apoptosis followingMycobacteriumtuberculosisinfection inhibits bacillary growth in an IFN-γ independent manner [J]. Tuberculosis (Edinb), 2002, 82(2-3): 55-61.

[13] Keane J, Remold HG, Kornfled H. VirulentMycobacteriumtuberculosisstrains evade apoptosis of infected alveolar macrophage [J]. J Immunol, 2000, 164(4): 2016-2020.

[14] 朱蘭卉，李馮銳，周懿舒，等. 細(xì)胞凋亡途徑中HIPPI的潛在調(diào)節(jié)作用[J]. 中國病理生理雜志，2013, 29(6): 1136-1141.

[15] López M, Sly LM, Luu Y, et al. The 19-KDaMycobacteriumtuberculosisprotein induces macrophage apoptosis through Toll-like receptor-2 [J]. J Immunol, 2003, 170(5): 2409-2416.