卡維地洛對RyR2介導的自發(fā)性鈣振蕩的抑制作用*

肖建民， 付 暉

(1東莞市太平人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東東莞523905;2廣東醫(yī)學院藥理教研室，廣東 東莞523808)

越來越多證據(jù)顯示，自發(fā)性鈣振蕩是心衰時發(fā)生心律失常及泵衰竭的重要機制之一。心衰時經(jīng)心肌細胞肌漿網(wǎng)上的鈣釋放通道——蘭尼定受體2(ryanodine receptor 2，RyR2)產(chǎn)生的自發(fā)性鈣釋放(spontaneous calcium release)明顯增多［1-2］。增強的自發(fā)性鈣釋放活性能激活內(nèi)向電流，如Na+/Ca2+交換電流，這種鈣激活的內(nèi)向電流能改變細胞膜電位，進而產(chǎn)生延遲后除極(delayed afterdepolarization，DAD)及觸發(fā)性心律失常，誘發(fā)惡性心律失常［3］。因此，心肌細胞肌漿網(wǎng)上的RyR2功能失調(diào)所致的鈣穩(wěn)態(tài)失衡在惡性心律失常發(fā)生中扮演著重要角色，是心衰時患者死亡的原因之一［4］。β腎上腺素受體阻滯劑是慢性心衰的標準治療藥物，通過阻滯交感神經(jīng)及兒茶酚胺活性以抑制心律失常及心室重構。多項臨床研究證實，β受體阻滯劑可以降低心衰患者死亡率，但并非所有β受體阻滯劑在降低心衰死亡率上都具有同等效果，其具體原因目前還不清楚。

COMET研究顯示，卡維地洛降低心衰死亡率的效果明顯優(yōu)于美托洛爾。一般認為，卡維地洛的優(yōu)勢源于其抗氧化作用及對α1和β1受體的非選擇性作用［5］。但是否還有別的機制參與其中，例如卡維地洛對自發(fā)性鈣振蕩有沒有影響，目前還未見報道。本研究采用急性分離的大鼠心肌細胞和構建能穩(wěn)定表達RyR2的HEK293細胞株，并以胞內(nèi)鈣影像技術檢測卡維地洛和其它14種常用的β受體阻滯劑如美托洛爾、索他洛爾、納多洛爾等對心肌細胞和HEK293細胞的RyR2介導的胞內(nèi)鈣振蕩的影響。結果證實卡維地洛是唯一可以抑制RyR2介導的自發(fā)性鈣振蕩的β受體阻滯劑，這可能是卡維地洛在降低心衰死亡率上優(yōu)于其它β受體阻滯劑的機制之一。

材料和方法

1 試劑和溶液

膠原酶、DNA連接酶、切割酶及卡維地洛和美托洛爾均購自Sigma。KRH緩沖液:125 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1.2 mmol/L KH2PO4，6 mmol/L glucose，1.2 mmol/L，MgCl2，25 mmol/L HEPES，pH 7.4。PBS 液:137 mmol/L NaCl， 8 mmol/L Na2HPO4，1.5 mmol/L KH2PO4和 2.7 mmol/L KCl。常規(guī)試劑均為分析純。

2 方法

2．1 構建可穩(wěn)定誘導表達RyR2的HEK293細胞株 首先在CMV啟動子下游，將RyR2 cDNA克隆進可經(jīng)四環(huán)素誘導表達的載體(pcDNA5/FRT/TO)中，然后采用Flp-In T-REx Core Kit(Invitrogen)構建可穩(wěn)定誘導表達RyR2的HEK293細胞株。簡單而言，用磷酸鈣沉淀法，將可誘導表達RyR2的pcDNA5/FRT/TO質(zhì)粒和可表達翻轉(zhuǎn)酶(flippase，F(xiàn)lp)重組酶的pOG44質(zhì)粒以1∶5的比例共同轉(zhuǎn)染Flp-In T-Rex-293細胞(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染24 h后，用PBS液輕輕清洗細胞并更換新鮮培養(yǎng)液。再經(jīng)24 h后，用PBS液將培養(yǎng)皿中的細胞洗脫并轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中。待細胞貼壁后(約4 h)，將培養(yǎng)液更換為含有200 mg/L潮霉素(Invitrogen)的細胞選擇性培養(yǎng)液。每3～4 d更換1次潮霉素培養(yǎng)液，直到細胞生長到足夠的密度。收集分裝這些抗潮霉素的HEK293細胞，保存于－80℃?zhèn)溆?。因為RyR2 cDNA由Flp重組酶介導、在同一個唯一的Flp重組酶作用靶點(Flp recombination target，F(xiàn)RT)插入 Flp-In T-Rex-293細胞基因組中，所以這些細胞具有良好的同源性。最后采用Western blotting檢測RyR2在HEK293細胞株中的表達狀況。

2．2 HEK293細胞株的鈣影像 采用單細胞鈣影像技術和鈣離子熒光示蹤劑Fura-2 AM檢測表達RyR2的HEK293細胞的胞內(nèi)鈣振蕩。在蓋玻片上培養(yǎng)HEK293細胞株，以1 kg/L四環(huán)素(Sigma)誘導表達24或30 h后，在常溫下(22℃)，用含5 mol/L Fura-2 AM及0.02%普盧蘭尼克F-127和含0.1 g/L BSA的KRH緩沖液孵育細胞20 min。將蓋玻片固定于特制灌流槽(Warner Instruments)后置于裝有S-Fluor 20x/0.75物鏡的倒置顯微鏡下(Nikon TE2000-S)，以含1 mmol/L CaCl2的KRH液持續(xù)灌流細胞，誘發(fā)自發(fā)性鈣振蕩。每4 s曝光1次，記錄Fura-2熒光強度(0.33 frames·s－1)。選定單個細胞，在其中心區(qū)域檢測熒光強度的變化，并以 SimplePCI 6軟件(Compix)對影像進行分析。測定藥物作用時，在灌流液中加不同濃度的β受體阻滯劑，比較加藥前后鈣振蕩的變化。實驗最后以10 mmol/L咖啡因灌流細胞，以證實HEK293細胞中有具功能活性的RyR2表達。只有那些對咖啡因有反應的細胞才能用作檢測和數(shù)據(jù)分析。

2．3 酶解分離大鼠心肌細胞 實驗動物均由廣東醫(yī)學院實驗動物中心(編號為SCKK-2008-0008)提供。如文獻所述［6］，采用酶解分離獲取單個大鼠心肌細胞，并在室溫下(22℃)將細胞保存于含20 mmol/L牛磺酸、5 g/L白蛋白和0.5 mmol/L CaCl2的KRH緩沖液中備用。

2．4 心肌細胞鈣影像 將用0.02%(W/V)明膠和10 kg/L纖維連接素處理過的玻璃蓋片固定于灌流槽(Warner Instruments)上。常溫下(22℃)，將心肌細胞置于玻璃蓋片上，用含5 mmol/L Fluo-4 AM及0.02% 普盧蘭尼克F-127和1 mmol/L CaCl2的KRH緩沖液孵育細胞20 min。從1 mmol/L起逐步緩慢提高灌流液中鈣離子濃度至6 mmol/L，然后以含6 mmol/L CaCl2的KRH液持續(xù)灌流細胞，以誘發(fā)心肌細胞自發(fā)性鈣震蕩。采用裝有S-Fluor 20x/0.75物鏡的倒置顯微鏡(Nikon TE2000-S)，每0.4 s曝光1次，記錄Fluo-4熒光強度(1.68 frames·s－1)。選定單個細胞，在其中心區(qū)域檢測熒光強度的變化，并以SimplePCI 6軟件對影像進行分析。測定藥物作用時，在灌流液中加不同濃度的β受體阻滯劑，比較加藥前后鈣振蕩的變化。其余同2．2。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HEK293細胞中RyR2的表達

如圖1所示，在構建可穩(wěn)定誘導表達RyR2的HEK293細胞株后，我們采用Western blotting方法檢測了RyR2蛋白在HEK293細胞上的表達效率，并與心肌細胞對比。結果發(fā)現(xiàn)，按照前文2．1所示方法可建立穩(wěn)定表達RyR2的HEK293細胞株，其RyR2蛋白含量與心肌細胞無明顯區(qū)別。

Figure 1．The expression of RyR2 in HEK293 cell line and ventricular myocytes．圖1 HEK293細胞株和心肌細胞上RyR2的表達

2 卡維地洛而非美托洛爾可明顯抑制心肌細胞自發(fā)性鈣振蕩

卡維地洛可濃度依賴性地抑制心肌細胞的自發(fā)性鈣振蕩?？ňS地洛1、3、10、30和60μmol/L對心肌細胞自發(fā)性鈣振蕩的抑制率分別為(10.10±1.20)%、(34.57±3.50)%、(52.31±4.70)%、(65.30±2.30)%和(86.84 ±3.20)%。美托洛爾1、3、10、30 和60μmol/L對心肌細胞自發(fā)性鈣振蕩的抑制率分別為(0.44±0.12)%、(0.80±0.10)%、(6.46±0.50)%、(16.04±1.20)%，明顯低于同等劑量下卡維地洛的作用。我們繼續(xù)加大美托洛爾的劑量，發(fā)現(xiàn)美托洛爾100μmol/L和300μmol/L對心肌細胞自發(fā)性鈣振蕩的抑制率仍比較低，分別為(19.25±0.70)%和(26.28±1.90)%。2組相比，各個濃度值差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖2。

3 卡維地洛而非美托洛爾可明顯抑制表達RyR2的HEK293細胞株的自發(fā)性鈣振蕩

卡維地洛可濃度依賴性地抑制HEK293細胞株的自發(fā)性鈣振蕩?？ňS地洛1、3、10、30和60μmol/L對表達RyR2的HEK293細胞株自發(fā)性鈣振蕩的抑制率分別為(1.50±0.10)%、(7.49±1.50)%、(34.72±4.20)%、(69.08±5.30)%和(97.49±6.20)%，而美托洛爾 1、3、10、30 和 60 μmol/L 對HEK293細胞株自發(fā)性鈣振蕩的抑制率在所檢測的各個濃度均為0。我們繼續(xù)加大美托洛爾的劑量，發(fā)現(xiàn)在HEK293細胞株，即使美托洛爾濃度升高至300 μmol/L仍不能抑制自發(fā)性鈣振蕩。2組相比，各個濃度值差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見圖3。

Figure 2．Effects of carvedilol and metoprolol on the spontaneous calcium release in ventricular cardiomyocytes．Cells were treated with carvedilol at 1，3，10，30 and 60 μmol/L(A，1 μmol/L is not shown)and metoprolol at 1，3，10，30，60，100 and 300 μmol/L(B，1 and 60μmol/L are not shown)．Carvedilol can significantly suppress the spontaneous calcium release，but metoprolol has no obvious effect on the spontaneous calcium release(C)．Mean±SEM．＊＊P ＜0.01 vs metoprolol．圖2 卡維地洛和美托洛爾對心肌細胞自發(fā)性鈣釋放的作用

Figure 3．Effects of carvedilol and metoprolol on the RyR2-mediated spontaneous calcium release in HEK293 cell line．Cells were treated with carvedilol at 1，3，10，30 and 60μmol/L(A，60μmol/L is not shown)and metoprolol at 1，3，10，30，60，100 and 300 μmol/L(B，1 and 60μmol/L are not shown)．Carvedilol can significantly suppress the spontaneous cal-cium release，but metoprolol has no effect on the spontaneous calcium release(C)．Mean±SEM．＊＊P ＜0.01 vs metoprolol．圖3 卡維地洛和美托洛爾對RyR2介導的HEK293細胞株自發(fā)性鈣釋放的作用

4 各種不同β受體阻滯劑對心肌細胞及表達RyR2的HEK293細胞株自發(fā)性鈣振蕩的影響

進一步分別檢測30μmol/L卡維地洛、美托洛爾、納多洛爾、普萘洛爾、索他洛爾、醋丁洛爾、烯丙洛爾、阿替洛爾、倍他洛爾、比索洛爾、艾司洛爾、拉貝洛爾、吲哚洛爾和噻嗎洛爾等14種β受體阻滯劑對心肌細胞和表達RyR2的HEK293細胞株自發(fā)性鈣振蕩的抑制作用。如圖4所示，各種不同β受體阻滯劑中僅卡維地洛可以明顯抑制心肌細胞和HEK293細胞株自發(fā)性鈣振蕩，其它13種β受體阻滯劑僅有輕微抑制或完全沒有作用。

Figure 4．Effects of various kinds ofβ-blockers(30μmol/L)on spontaneous calcium release in ventricular cardiomyocytes(A)and HEK293 cells(B)．Only carvedilol can inhibit spontaneous calcium release in both cells．1:acebutolol;2:alprenolol;3:atenolol;4:betaxolol;5:bisoprolol;6:carvedilol;7:esmolol;8:labetalol;9:metoprolol;10:nadolol;11:indolol;12:propranolol;13:sotalol;14:timolol．Mean±SEM．n=246 in carvedilol group;n=200 in other groups．圖4 30μmol/L各種β受體阻滯劑對心肌細胞和HEK293細胞株自發(fā)性鈣釋放的作用

討 論

1999年和2001年公布的 CIBIS II、MERIT-HF和COPERNICUS研究分別證實了比索洛爾、琥珀酸美托洛爾和卡維地洛可以降低慢性收縮性心力衰竭總死亡率34% ～35%，被認為是里程碑式的研究，奠定了β受體阻滯劑在慢性收縮性心力衰竭治療中的堅實地位［7-9］。

然而，并非所有β受體阻滯劑均能獲得相同的療效。在BEST研究［10］中采用具有α阻斷作用的非選擇性β受體阻滯劑布新洛爾治療慢性心力衰竭，其結果并不優(yōu)于安慰劑。在COMET研究［5］中，卡維地洛比酒石酸美托洛爾更好地降低死亡率。而且，在不同收縮壓、心率和β受體阻滯劑劑量情況下，接受卡維地洛治療的患者死亡率均顯著低于接受美托洛爾治療的患者;無論血漿氨基末端腦利鈉肽前體的濃度如何，卡維地洛治療均比美托洛爾有優(yōu)勢;從美托洛爾轉(zhuǎn)換到卡維地洛，相比從卡維地洛轉(zhuǎn)換到美托洛爾，其嚴重不良事件、死亡率和住院率均較低。雖然以上多項臨床研究都證實卡維地洛優(yōu)于美托洛爾，但其具體機制還未闡明。有報道卡維地洛對腎上腺素受體的非選擇性阻斷及其抗氧化作用可能是原因之一［11］，是否還存在其它機制目前還不清楚。

本實驗采用鈣影像技術檢測了卡維地洛、美托洛爾等多種β受體阻滯劑對心肌細胞自發(fā)性鈣振蕩的作用，結果發(fā)現(xiàn)相對于其它14種β受體阻滯劑，卡維地洛可明顯抑制心肌細胞的自發(fā)性鈣振蕩。由此我們首次提出了卡維地洛特有的對心肌細胞自發(fā)性鈣振蕩的抑制作用。

心肌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的維持及自發(fā)性鈣振蕩的發(fā)生涉及多個環(huán)節(jié)，研究證實，RyR2功能失調(diào)在自發(fā)性鈣振蕩的發(fā)生中扮演著重要角色，是心衰時發(fā)生惡性心律失常導致死亡的原因之一［12-14］。為進一步證實卡維地洛對心肌細胞自發(fā)性鈣振蕩的抑制是不是由RyR2介導，我們制備了表達RyR2的HEK293細胞株，發(fā)現(xiàn)在所有檢測的14種β受體阻滯劑中，發(fā)現(xiàn)只有卡維地洛能抑制表達RyR2的HEK293細胞株的自發(fā)性鈣振蕩。在前期實驗中，我們發(fā)現(xiàn)卡維地洛急性灌流并不能改變HEK293細胞株上RyR2的表達(結果中未顯示)，而本實驗發(fā)現(xiàn)同樣給藥方式下卡維地洛可明顯抑制表達RyR2的HEK293細胞株的自發(fā)性鈣振蕩，提示卡維地洛急性給藥主要影響RyR2的功能，而對其含量和表達無顯著影響。由此證實RyR2是卡維地洛抑制心肌細胞自發(fā)性鈣振蕩的靶點。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在所檢測的14種β受體阻斷劑中，只有卡維地洛能夠抑制RyR2介導的心肌細胞自發(fā)性鈣振蕩，提示卡維地洛對自發(fā)性鈣振蕩的獨特作用可能是卡維地洛降低心衰死亡率的效果明顯優(yōu)于美托洛爾等其它β受體阻滯劑的原因之一，同時也為心衰時針對RyR2這一靶點的抗心律失常治療提供了新的理論基礎。