siRNA沉默MIF基因?qū)μ瞧べ|(zhì)激素抑制脂質(zhì)炎癥介質(zhì)釋放的影響及其機(jī)制*

孫　瑜，　韓　姝，　王俊杰，　夏照帆

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院燒傷科，上海 200433)

炎癥是機(jī)體對(duì)感染、體內(nèi)抗原抗體結(jié)合以及機(jī)械損傷的一種自身反應(yīng)。適度的炎癥反應(yīng)是有益的，而過(guò)度的或持續(xù)的炎癥反應(yīng)則會(huì)引起組織損傷和誘發(fā)疾病。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)可以糾正炎癥反應(yīng)的失調(diào)，在臨床中廣泛使用。然而過(guò)度或不適當(dāng)?shù)貞?yīng)用GC也會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，引起兒童生長(zhǎng)遲緩，免疫抑制，高血壓，延緩傷口愈合，骨質(zhì)疏松以及代謝紊亂等[1]。因GC療效不滿意而需要大劑量和長(zhǎng)期使用激素替代療法是臨床過(guò)度使用GC的最常見原因。近幾年的研究表明，體內(nèi)在應(yīng)激或某些疾病狀態(tài)下產(chǎn)生的抵抗GC抗炎作用的細(xì)胞因子是GC療效不滿意的關(guān)鍵影響因素，其中已證實(shí)的就是巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration-inhibitory factor, MIF)。MIF是一種主要由巨噬細(xì)胞激活的T細(xì)胞及垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)素細(xì)胞等合成和分泌的多功能細(xì)胞因子，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移等多種病理生理反應(yīng)[2]。迄今為止，MIF是唯一被認(rèn)為能負(fù)向調(diào)節(jié)GC抗炎作用的細(xì)胞因子，它可能與局部或全身炎癥、自身免疫性疾病等密切相關(guān)，亦可能是GC不能有效發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵因子[2]。MIF是如何抵抗糖皮質(zhì)激素的抗炎作用的，其機(jī)制至今仍未完全闡明。本研究采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)阻斷細(xì)胞內(nèi)MIF蛋白的表達(dá)，觀察其對(duì)糖皮質(zhì)激素抑制細(xì)胞釋放脂質(zhì)炎癥介質(zhì)的影響及可能機(jī)制。

材　料　和　方　法

1材料

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW264.7由本實(shí)驗(yàn)室保存；地塞米松(dexamethasone，Dex)由第二軍醫(yī)大學(xué)病理生理學(xué)教研室盧建教授惠贈(zèng)；重組的小鼠MIF細(xì)胞因子購(gòu)自R&D；兔抗小鼠Annexin 1抗體購(gòu)自Santa Cruz；兔抗小鼠的胞漿磷脂酶A2α(cytosolic phospholipase A2α,cPLA2α)和磷酸化cPLA2α(p-cPLA2α)抗體購(gòu)自Cell Signaling；HRP標(biāo)記的小鼠β-actin單克隆抗體購(gòu)自Sigma；羊抗小鼠的前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和白三烯B4(leukotrienes B4, LTB4)的ELISA試劑盒購(gòu)自Adlitteram Diagnostic Laboratories。針對(duì)小鼠MIF的RNA干擾質(zhì)粒及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的TOP10穿刺菌由南京金思特公司提供；經(jīng)過(guò)篩選的MIFsiRNA序列為： 5’-GGATCCCGTTCATGTCGTAATAGTTGATGTTGATATCCGCATCAACTATT-ACGACATGAATTTTTTCCAAAAGCTT-3’。對(duì)照(control) siRNA為：5’-GGATCCCATCTTGCCGATGCTGTGCAGGTTGATATCCGCCTGCACAGCATCGGCAAGATTTTT-TTCCAAAAGCTT-3’。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，隔天傳代。

2.2去激素血清制備參照文獻(xiàn)[3]用葡聚糖包被的木炭吸附(dextran-coated charcoal，DCC)方法進(jìn)行。過(guò)程如下：分別稱取活性炭2 g和Dextran T-70 200 mg，用去離子水定容至100 mL，用在磁力攪拌機(jī)上攪拌1 h后，以4 000 r/min離心10 min，去上清后在離心管內(nèi)加入100 mL小牛血清，并與沉淀混勻，在磁力攪拌機(jī)上攪拌30 min后，在超速離心機(jī)中，20 000 r/min，離心15 min，重復(fù)1次后將上清與無(wú)酚紅的RPMI-1640混合，過(guò)濾除菌后，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3免疫熒光法觀測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染前24 h消化細(xì)胞，傳代于6孔板，第2天按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書操作，按照濃度梯度加入綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記的siRNA， 熒光siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，6 h后PBS沖洗1次，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.4RT-PCR檢測(cè)MIF mRNA的表達(dá)MIF引物(341 bp)：正義鏈5’-ACACCAATGTTCCCCGC-3’, 反義鏈5’-AAGCGAAGGTGGAACCGT-3’；β-actin引物 (211 bp)：正義鏈5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，反義鏈5’-GTACTCCTGCTTGCTGATGC-3’。Trizol提取總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在普通PCR儀上擴(kuò)增目的DNA，條件為:MIF，94 ℃ 2 min, 51 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s(30個(gè)循環(huán))；β-actin，94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s(34個(gè)循環(huán))，最后于72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1～2%瓊脂糖凝膠中電泳并拍照。

2.5ELISA方法檢測(cè)上清中PGE2和LTB4的含量不同濃度的LPS、MIF和Dex刺激RAW264.7細(xì)胞后檢測(cè)培養(yǎng)上清中PGE2和LTB4含量的變化。或先加入Dex或Dex+MIF孵育1 h，在給予LPS刺激4 h后檢測(cè)上清中PGE2和LTB4的變化。

2.6Western blotting測(cè)定蛋白水平收集全細(xì)胞蛋白標(biāo)本，常規(guī)BCA方法進(jìn)行蛋白定量。制備12%聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE(2 h)，轉(zhuǎn)移到NC膜(50 min)，室溫5%BSA封閉1 h，與目標(biāo)蛋白抗體孵育4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，加HRP偶聯(lián)的Ⅱ抗(1∶5 000)，孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色曝光。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析。方差齊性時(shí)使用SNK法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’C方法作多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1MIFsiRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率

siRNA表達(dá)載體上帶有GFP，轉(zhuǎn)染24 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，MIFsiRNA的轉(zhuǎn)染效率在70%左右，control siRNA的轉(zhuǎn)染效率在80%左右，見圖1。

Figure 1. The GFP expression in RAW264.7 macrophages 24 h after transfection with control siRNA (A) orMIFsiRNA (B) observed under fluorescence microscope (×100).

圖1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡觀測(cè)GFP表達(dá)

2MIFsiRNA干擾效率的檢測(cè)

圖2可見MIFsiRNA質(zhì)粒以劑量依賴性方式降低了RAW264.7細(xì)胞中MIF mRNA的量，當(dāng)加入2.0 mg/LMIFsiRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，MIF基因完全沉默(P<0.01)。如圖3所示，MIFsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后MIF蛋白表達(dá)顯著降低，且有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)加入2.0 mg/LMIFsiRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，胞漿中幾乎沒有MIF蛋f白表達(dá)(P<0.01)。

從上述2個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果我們得出，MIFsiRNA質(zhì)粒(2.0 mg/L)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后可完全阻斷MIF基因的翻譯和蛋白表達(dá)，得到MIF基因敲除的RAW264.7細(xì)胞，下面的實(shí)驗(yàn)我們將采用此濃度進(jìn)行RNA干擾后的細(xì)胞處理。

3MIFsiRNA對(duì)Dex抑制PGE2和LTB4產(chǎn)生的影響

如圖4所示，在轉(zhuǎn)染了control siRNA質(zhì)粒的細(xì)胞中，100 nmol/L的Dex對(duì)PGE2的抑制作用能達(dá)到30%，而在轉(zhuǎn)染了MIFsiRNA的細(xì)胞中，只需要10 nmol/L Dex就能達(dá)到相同的效果(圖4A)。同樣，在轉(zhuǎn)染了MIFsiRNA質(zhì)粒的細(xì)胞中，10 nmol/L Dex對(duì)LTB4產(chǎn)生的抑制率為20%，而對(duì)轉(zhuǎn)染了control siRNA質(zhì)粒的細(xì)胞則需要100 nmol/L Dex才能達(dá)到同樣的效果(圖4B)。上述結(jié)果表明內(nèi)源性MIF表達(dá)被抑制的細(xì)胞，對(duì)Dex抑制PGE2和LTB4的作用的敏感性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(約10倍)。

Figure 2. The effect ofMIFsiRNA expression plasmid transient transfection on MIF mRNA expression in RAW264.7 macrophages.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vs0.5 mg/LMIFsiRNA;##P<0.01vs1.0 mg/LMIFsiRNA.

圖2MIFsiRNA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)RAW264.7細(xì)胞中MIFmRNA表達(dá)的影響

Figure 3. The effect ofMIFsiRNA plasmid transient transfection on MIF protein expression in RAW264.7 macrophages.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vs2.0 mg/LMIFsiRNA;##P<0.01vs1.0 mg/LMIFsiRNA.

圖3MIFsiRNA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)RAW264.7細(xì)胞中MIF蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.MIFknockdown endanced Dex-induced inhibiton of PGE2(A) and LTB4(B) production in RAW264.7 macrophages.*P<0.05,**P<0.01vscontrol siRNA.

圖4抑制細(xì)胞內(nèi)源性MIF表達(dá)能增強(qiáng)Dex抑制PGE2和LTB4產(chǎn)生的作用

4MIFsiRNA對(duì)Dex上調(diào)Annexin1表達(dá)的影響

如圖5所示，MIFsiRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比， Dex誘導(dǎo)Annexin 1蛋白表達(dá)的作用變得更明顯(P<0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，表明在內(nèi)源性MIF表達(dá)減少的情況下，拮抗Dex作用的細(xì)胞因子減弱，因而放大了Dex對(duì)Annexin 1表達(dá)的促進(jìn)作用。

Figure 5. The effect ofMIFsiRNA on Annexin 1 expression in RAW264.7 macrophages induced by Dex.**P<0.01vsDex 0 nmol/L;△△P<0.01vsDex 1 000 nmol/L;##P<0.01vsDex 100 nmol/L.

圖5MIFsiRNA對(duì)Dex誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞Annexin1表達(dá)的影響

5MIF逆轉(zhuǎn)Dex抑制的cPLA2α磷酸化

外源性MIF能夠逆轉(zhuǎn)Dex對(duì)cPLA2α磷酸化的抑制作用，而減少內(nèi)源性MIF的表達(dá)能增強(qiáng)Dex對(duì)cPLA2α磷酸化的抑制作用(圖6)。在LPS刺激下，cPLA2α的磷酸化水平明顯升高(圖6B、D)，Dex能明顯抑制由LPS引起的cPLA2α磷酸化，但加入外源性MIF則能逆轉(zhuǎn)Dex對(duì)cPLA2α磷酸化的抑制作用。相反，如果減少內(nèi)源性MIF表達(dá)，Dex對(duì)LPS引起的cPLA2α活化的抑制作用就更為明顯(圖6C、D)。

討　　論

MIF最早被認(rèn)為是T細(xì)胞來(lái)源的淋巴因子，因能抑制巨噬細(xì)胞的遷移而得名。隨后研究表明除了T細(xì)胞外，其它合成和釋放MIF的細(xì)胞還有巨噬細(xì)胞、各種組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。人類MIF基因位于22號(hào)染色體，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。MIF是含115個(gè)氨基酸、分子量為12.5 kD的蛋白質(zhì)，它與已知的蛋白質(zhì)之間無(wú)明顯的氨基酸同源性，不屬于任何已知的細(xì)胞因子家族，并且具有多種生物學(xué)功能。MIF不僅作為重要的細(xì)胞因子參與機(jī)體的炎癥及免疫反應(yīng)，而且和細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化有著密切的聯(lián)系[4]。越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明，MIF涉及機(jī)體各種炎癥性、自身免疫性疾病及多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制[5-6]。MIF的另一個(gè)重要特點(diǎn)是具有拮抗GC抑制炎癥的作用[2]。MIF不但在全身多種炎癥性疾病中高表達(dá)，而且還能拮抗GC的抗炎作用，然而目前大多數(shù)炎癥性疾病臨床上仍需依賴GC治療，因而MIF的存在可能大大減弱了GC對(duì)于炎癥性疾病的療效。

體外研究證實(shí)MIF能負(fù)向調(diào)節(jié)GC抑制TNF-α、IL-1等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，但對(duì)于脂質(zhì)炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)作用未見報(bào)道。我們的研究首先證實(shí)應(yīng)用MIFsiRNA減少細(xì)胞內(nèi)源性MIF蛋白表達(dá)能夠增強(qiáng)GC抑制脂質(zhì)炎癥介質(zhì)PGE2和LTB4的釋放。

Figure 6. MIF counter-regulated Dex-induced inhibition of cPLA2α phosphorylation. A, B, C: Western blotting; D: semiquantitative analysis of p-cPLA2α/cPLA2α;**P<0.01vscontrol siRNA;##P<0.01vsMIF;△△P<0.01vscontrol;▲▲P<0.01vsLPS.

圖6MIF對(duì)Dex抑制cPLA2α磷酸化的影響

這一結(jié)果表明MIF參與了脂質(zhì)炎癥介質(zhì)的調(diào)控，對(duì)MIF拮抗GC抗炎作用的內(nèi)容作了一定的補(bǔ)充。

相對(duì)于MIF來(lái)說(shuō)，人們對(duì)GC的研究歷經(jīng)幾十年，已研究證實(shí)GC與GC受體(glucocorticoid receptor，GR)特異結(jié)合后，分別經(jīng)3條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(MAPK、NF-κB和Annexin 1-cPLA2α)來(lái)抑制促炎細(xì)胞因子和脂質(zhì)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放[1]。以往研究發(fā)現(xiàn)MIF正是通過(guò)干擾了GC的經(jīng)典信號(hào)通路從而負(fù)向調(diào)節(jié)GC抗炎作用。GC可通過(guò)快速、持續(xù)誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(MAP kinase phosphatase-1, MKP-1)表達(dá)，進(jìn)而反饋抑制p38活化，而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)。MKP-1屬于MKP家族的一員，能夠通過(guò)去磷酸化MAPK的絲/蘇氨酸殘基而使MAPK失活。MKP-1在機(jī)體中組成性表達(dá)，但能被GC強(qiáng)誘導(dǎo)。GC通過(guò)誘導(dǎo)MKP-1基因表達(dá)及減少M(fèi)KP-1蛋白降解使MKP-1合成增加。Aeberli等[7]發(fā)現(xiàn)在MIF基因敲除動(dòng)物的腹腔巨噬細(xì)胞中，內(nèi)源性或重組的MIF可對(duì)抗GC誘導(dǎo)的MKP-1表達(dá)，可造成p38 MAPK持續(xù)活化。而p38 MAPK的持續(xù)活化即可通過(guò)調(diào)節(jié)活化蛋白1的活性在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)。Roger等[8]也發(fā)現(xiàn)在RAW264.7巨噬細(xì)胞系，重組MIF對(duì)GC誘導(dǎo)的MKP-1表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。上述研究表明MKP-1成為MIF拮抗GC抗炎作用的關(guān)鍵蛋白之一。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，GC通過(guò)與胞漿中的GR結(jié)合為復(fù)合物并轉(zhuǎn)移到核中，促進(jìn)IκB的轉(zhuǎn)錄，從而抑制炎癥介質(zhì)的釋放。而IκB是一種阻礙蛋白，可阻礙免疫細(xì)胞胞漿中的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的釋放，如果IκB崩解則NF-κB可釋放并活化，轉(zhuǎn)移到胞核中激活炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。MIF正是通過(guò)抑制GC對(duì)胞漿中IκBα表達(dá)的上調(diào)，以對(duì)抗激素在NF-κB/IκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的效應(yīng)，進(jìn)而阻斷了其對(duì)炎癥因子表達(dá)的限制作用[9]。這就表明IκBα也成為了MIF拮抗GC作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

除了上述2個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之外，GC-GR復(fù)合物還能介導(dǎo)Annexin 1-cPLA2α信號(hào)通路。Annexin 1，又叫膜聯(lián)蛋白1或脂皮質(zhì)素1，是一種抗炎蛋白，正常情況下通過(guò)與cPLA2α發(fā)生作用而抑制其活性[10-11]。cPLA2α在炎癥刺激下激活，表現(xiàn)為從胞漿移動(dòng)到核膜周圍，并將磷脂水解成花生四烯酸。GC能誘導(dǎo)并激活A(yù)nnexin 1，通過(guò)抑制cPLA2α來(lái)阻止花生四烯酸的產(chǎn)生和向類花生酸類物質(zhì)的轉(zhuǎn)變(如前列腺素、血栓素、前列環(huán)素和白三烯)。前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)初步證實(shí)MIF能夠抵抗糖皮質(zhì)激素抑制脂質(zhì)炎癥介質(zhì)PGE2和LTB4的釋放，那么MIF抵抗糖皮質(zhì)激素的抗炎作用是否也和此信號(hào)通路相關(guān)呢？我們研究發(fā)現(xiàn)MIFsiRNA能夠增強(qiáng)Dex誘導(dǎo)Annexin 1的表達(dá)，進(jìn)而抑制Annexin1下游蛋白cPLA2α的磷酸化，表明在內(nèi)源性MIF表達(dá)減少的細(xì)胞中，拮抗Dex作用的因素減弱，因而放大了Dex對(duì)Annexin 1表達(dá)的促進(jìn)作用。Annexin 1的表達(dá)增加更增強(qiáng)了對(duì)其下游蛋白cPLA2α磷酸化的抑制作用，最終減少PGE2和LTB4的釋放。

MKP-1和IκBα作為GC誘導(dǎo)的抗炎蛋白，也是MIF對(duì)抗GC抗炎作用的靶蛋白，我們的研究結(jié)果首次顯示Annexin 1可能也是MIF拮抗GC抗炎作用的關(guān)鍵蛋白。Annexin 1作為GC誘導(dǎo)的抗炎蛋白之一，其在胞漿內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的位置和MKP-1以及IκBα十分相似，都是信號(hào)通路中的上游蛋白。鑒于這3個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路中的上游蛋白均在MIF負(fù)向調(diào)節(jié)GC抗炎作用機(jī)制中扮演重要角色，因此通過(guò)增強(qiáng)其中一個(gè)蛋白的活性只能部分對(duì)抗MIF抵抗GC的作用，從而也說(shuō)明了MIF在細(xì)胞內(nèi)作用的廣泛性和有效性。

本研究初步揭示了MIF負(fù)向調(diào)節(jié)GC抗炎作用的關(guān)鍵性分子是GC誘導(dǎo)的抗炎蛋白Annexin 1，即MIF可能通過(guò)干擾GC誘導(dǎo)Annexin 1的表達(dá)及其下游信號(hào)通路來(lái)對(duì)抗GC本身的抗炎作用。闡明這個(gè)分子機(jī)制，有助于更全面地了解GC不能有效發(fā)揮抗炎作用的原因，為臨床解釋某些炎癥性疾病存在的GC療效不滿意現(xiàn)象提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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