中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白在小鼠呼吸機所致肺損傷模型中的表達*

肖　銳，　陳榮昌

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 511400； 2呼吸疾病國家重點實驗室，廣州市呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510320)

目前，機械通氣支持治療在重癥監(jiān)護病房中得到普遍應(yīng)用，特別是在救治急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合癥的病人發(fā)揮了重要作用。盡管機械通氣有挽救生命的作用，它也能導致健康肺或有基礎(chǔ)疾病肺的嚴重損傷。天然免疫和炎癥反應(yīng)在“生物傷”中的重要作用日益受到重視，它們之間形成的復(fù)雜的免疫炎癥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子也是研究者們選擇作為呼吸機所致肺損傷生物標志物的優(yōu)先候選分子。

研究發(fā)現(xiàn)機械通氣過程中的物理牽拉和剪切應(yīng)力能誘導炎癥細胞募集和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。中性粒細胞和其介質(zhì)參與了呼吸機所致肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)的形成[1]。白細胞的激活和吸引是發(fā)生“生物傷”的重要特征。動物實驗發(fā)現(xiàn)中性粒細胞缺乏的動物VILI發(fā)生的可能性顯著降低。中性粒細胞在持續(xù)性肺損傷的正反饋環(huán)中處于一個中心地位[2]。中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)是一種陽性急性期蛋白。NGAL作為一種分泌蛋白，主要在粒細胞前體細胞和各種上皮細胞中表達[3]。肺泡上皮細胞在炎癥反應(yīng)中既是效應(yīng)細胞又是靶細胞，在VILI的病理生理演變過程中具有重要作用[4]。因此，我們設(shè)想NGAL可能作為機械力和炎癥刺激的感受器參與了VILI的發(fā)病機制。由于NGAL具有廣泛參與炎癥和免疫反應(yīng)的生物學特性；并且是一種急性期反應(yīng)的分泌蛋白，易于在血清和肺泡灌洗液中檢測到；并且是與中性粒細胞密切相關(guān)的重要分子，鑒于這些特性，NGAL是作為VILI生物標志物的最佳候選靶標。我們實驗?zāi)康氖怯^察小鼠VILI模型中不同機械通氣策略對NGAL表達的影響，希望能為早期診斷VILI找到新的生物標志物。

材　料　和　方　法

1材料

Trizol試劑購自Invitrogen。 AffinityScript qPCR cDNA 合成試劑盒和2×BrilliantⅡSYBR Green qPCR Master 試劑盒購自Stratagene。RIPA裂解液和BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒購自Pierce?？剐∈螃?actin單克隆抗體購自Santa Cruz。大鼠抗小鼠NGAL單克隆抗體購自R&D Systems；兔抗大鼠IgG-H&L(HRP)抗體購自 Abcam；發(fā)光底物試劑盒(SuperSignal? West Pico Chemiluminescent Substrate)購自Pierce。免疫組化染色試劑盒購自Zymed。

2.1小鼠呼吸機相關(guān)性肺損傷動物模型的建立雄性C57BL/6小鼠，共30只，6至8周齡，體重21.0～28.4 g。小鼠用戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉。氣管切開，插入氣管導管， 動物取仰臥位置于Buxco動物生理信號采集系統(tǒng)的動物倉內(nèi)，連接容量控制型小動物呼吸機(Harvard, Model 683)或壓力控制型小動物呼吸機(Harvard, Model BS4 55-7059 Inspira)。氣道壓力和通氣流量用Buxco動物生理信號采集系統(tǒng)監(jiān)測。實驗動物隨機分為5組：(1)對照組: 小鼠氣管切開插管后自主呼吸2 h,n=6。(2)高吸氣末峰壓(high peak inflation pressure，H-PIP;n=6)組：小鼠連接呼吸機后，給予50 cmH2O PIP和2.5 cmH2O 呼氣末正壓(positive end-expiratory pressure，PEEP)，呼吸頻率17 breaths/min、潮氣量約1 mL，通氣2 h。實驗過程中適當調(diào)整潮氣量以維持PIP在50 cmH2O。(3)低吸氣末峰壓(low peak inflation pressure，L-PIP;n=6)組：小鼠連接呼吸機后，給予15 cmH2O PIP，0 cmH2O PEEP，呼吸頻率120 breaths/min, 潮氣量約0.29 mL，通氣2 h。(4)大潮氣量(high volume，HV)組：小鼠連接呼吸機后，給予30 mL/kg、0 cmH2O PEEP，呼吸頻率65 breaths/min,通氣2 h。(5)小潮氣量(low volume，LV)組：小鼠連接呼吸機后，給予6 mL/kg、5 cmH2O PEEP，呼吸頻率135 breaths/min,通氣2 h。

2.2實驗動物標本的收集機械通氣結(jié)束后腹腔注入戊巴比妥鈉處死動物。(1)小鼠血清的收集：摘取小鼠眼球取外周血約0.6 mL，4 ℃放置過夜后5 000 r/min離心30 min，取上清，每管100 μL分裝，-70 ℃保存。進行Western blotting檢測。(2)小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的收集:收集完小鼠血清后，0.6 mL冰PBS液由注射器從氣管套管注入小鼠肺，反復(fù)抽吸3次，回收率約90%。4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清，每管100 μL分裝，-70 ℃保存。進行總蛋白測定及Western blotting檢測。(3)小鼠肺右葉取出后迅速放入液氮，次日放置-70 ℃保存。進行總蛋白提取，Western blotting檢測。小鼠肺左下葉取出后迅速放入液氮，次日放置-70 ℃保存。進行總RNA提取，real-time RT-PCR檢測。

2.3小鼠VILI模型復(fù)制的鑒定機械通氣(或自主呼吸)2 h 處死動物后，用1 mL冰4%多聚甲醛由注射器從氣管插管注入小鼠肺，用繩扎緊氣道。將整個肺取出放入冰4%多聚甲醛固定24 h后，做石蠟包埋，病理切片、貼片、脫蠟、脫水、HE染色、固定后封片行病理鏡檢。另外，用BCA法測定BALF中總蛋白濃度，按照試劑盒說明書配制工作液和稀釋標準品，加25 μL樣品和稀釋標準品到96孔酶標板的樣品孔中。再在各孔加入200 μL BCA工作液，搖動混勻30 s。封板，37 ℃放置30 min。冷卻到室溫，用酶標儀測定562 nm 的吸光度(A562)，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。

2.4小鼠VILI模型肺組織 NGAL mRNA 的表達利用 Primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計擴增NGAL基因片段所需的上、下游引物，以β-actin作為內(nèi)參照。引物序列由大連寶生物公司合成。稀釋至10 μmol/L, -20 ℃保存。引物序列(5’-3’)及擴增的片段長度如下：NGAL上游引物CCCTGAACTGAAGGAACG,下游引物TTGGTATGGTGGCTGGTG，產(chǎn)物大小231 bp；β-actin上游引物CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC,下游引物ATGGAGCCACCGATCCACA，產(chǎn)物大小171 bp。Real-time RT-PCR的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如下：第1鏈cDNA的合成是按照AffinityScript qPCR cDNA 合成試劑盒說明書配制20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，反應(yīng)條件為25 ℃ 5 min；42 ℃ 15 min；95 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA溶液用RNase-free dH2O稀釋到100 μL, -20 ℃保存。以上述cDNA溶液為模板按照BrilliantⅡSYBR Green qPCR Master 試劑盒說明書配制 real-time PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s，后兩步重復(fù)40個循環(huán)。所有的樣本都做復(fù)孔。每次檢測都包含有5個已知基因組DNA濃度的等比(10×)稀釋梯度和未加 cDNA 模板的陰性對照獲得的標準曲線。每次檢測包含有溶解曲線的分析。目的基因的表達量利用相對定量分析法，即ΔΔCt法：ΔCt樣本=Ct目的基因-Ct看家基因，ΔΔCt=ΔCt未知樣本-ΔCt對照樣本，相對表達水平=2-ΔΔCt。

2.5Western blotting法檢測NGAL 在肺組織、血清和BALF中的表達用BCA法檢測肺組織總蛋白提取液濃度，并將每個樣本濃度調(diào)整為1 g/L，進行變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜后加入1∶100稀釋的Ⅰ抗(大鼠抗小鼠NGAL單克隆抗體)搖床孵育，4 ℃過夜。洗膜之后用1∶1 000稀釋的酶標Ⅱ抗兔抗大鼠IgG-H&L(HRP)室溫下于搖床孵育1 h，反復(fù)洗膜4次，按發(fā)光底物試劑盒說明將A和B 2種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，放入Kodak Image Station 2000R凝膠成像系統(tǒng)中顯影。用凝膠成像系統(tǒng)分析軟件分析條帶灰度值，每個樣本均測3次。計算公式如下：目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/同一樣本β-actin蛋白的灰度值。

2.6免疫組織化學法檢測NGAL蛋白的表達部位將石蠟包埋的小鼠肺組織進行脫蠟和水化、洗片后抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體。滴加Ⅰ抗稀釋液50 μL, 4 ℃過夜。次日組織玻片在37 ℃復(fù)溫45 min，洗片。 滴加Ⅱ抗50 μL， 室溫靜置1 h。洗片3次后 DAB顯色10 min，自來水沖洗10 min。 蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化。自來水沖洗10 min后脫水、透明、封片、鏡檢。

3統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析和Tukey-Kramer多重比較檢驗法判斷組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

pH值，剩余葡萄糖含量和總蛋白質(zhì)含量具有一定影響?？Х葔A的添加能在一定程度上刺激冠突散囊菌的生長，但在發(fā)酵過程中，其含量并未出現(xiàn)明顯變化，這說明在該發(fā)酵系統(tǒng)中，冠突散囊菌既不能將其作為碳源、氮源分解代謝來維持生長，也不能利用共培養(yǎng)發(fā)酵體系中其他成分來合成咖啡堿。該結(jié)果與前人研究基本一致，且研究表明微生物體系中，利用真菌分解代謝咖啡因遠比細菌要難的多[18]，而且只發(fā)生在極少數(shù)的青霉屬和曲霉屬類群中，逐級代謝為茶堿和3-甲基黃嘌呤[19]。

結(jié)　　果

1小鼠VILI模型的復(fù)制

首先，觀察不同通氣策略小鼠肺組織病理改變，評價動物模型復(fù)制情況。從肺組織肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，在HV組和H-PIP組小鼠肺組織可見充血水腫，有5例小鼠肺組織表面可見暗紅色斑片狀病灶。鏡下觀察顯示正常對照組肺泡結(jié)構(gòu)正常(圖1A);LV組和L-PIP組也未見明顯形態(tài)學異常(圖1B、C);在HV組和H-PIP組，可見肺泡間隔增厚并有中性粒細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)紅細胞滲出，還有嗜伊紅染色的水腫液和纖維素(圖1D、E)。另外，用BCA法測定BALF中總蛋白的量(表1)。在損傷性肺通氣組，如H-PIP組和HV組BALF中的總蛋白量比正常對照組分別升高了約4.03和2.09倍。結(jié)合病理改變及肺泡腔中蛋白滲出、總蛋白量明顯增加等指標,可認為該模型是成功的。

Figure 1. Pathological changes of mouse lung tissues after exposure to different strategies of mechanical ventilation (HE staining,×400).A: control group; B: LV group; C: L-PIP group; D: HV group; E: H-PIP gourp.

圖1不同通氣策略下小鼠肺組織的病理改變

2不同通氣模式對NGALmRNA表達的影響

正常肺組織有少量NGAL mRNA的表達。LV組通氣2 h后，NGAL mRNA的表達比對照組升高了3.63倍(P<0.01)。 HV組NGAL mRNA的表達也較對照組升高了3.29倍(P<0.01)，但是HV組與LV組相比，NGAL mRNA的表達沒有顯著差異(P>0.05)。在壓力控制型機械通氣中，NGAL mRNA的表達比正常組仍是增加的，分別為對照組的2.10和41.9倍(P<0.01)，在H-PIP組NGAL mRNA的表達水平最高，提示損傷性機械通氣策略能使NGAL mRNA的表達顯著增加，見圖2。

表1急性肺損傷小鼠BALF中總蛋白含量

Table 1. Total protein in BALF in mouse model of ALI(mg/L.Mean±SD.n=6)

GroupTotalproteininBALFControl621．12±8．67LV1137．50±3．12HV1304．33±4．89L?PIP1266．67±2．78H?PIP2500．00±4．09?

*P<0.05vscontrol.

Figure 2. Expression of NGAL mRNA in mouse lung tissues after exposure to different strategies of mechanical ventilation detected by real-time RT-PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsHV group.

圖2實時定量RT-PCR測定不同通氣策略下小鼠肺組織NGALmRNA的表達

3不同通氣模式對NGAL蛋白表達的影響

NGAL的蛋白表達變化與其mRNA的變化趨勢基本一致。在BALF中H-PIP組NGAL的蛋白表達量較其它組明顯增高，約是正常對照組的4倍、HV組的2倍(均P<0.01)；而且其在BALF內(nèi)的量明顯高于在血清和肺組織的表達量。在LV組和L-PIP組，NGAL蛋白表達稍微升高，在肺組織、BALF和血清中的表達水平無明顯差異(P>0.05)，見圖3。

4NGAL蛋白在VILI小鼠動物模型中的作用部位

NGAL主要表達在肺組織的血管內(nèi)皮細胞和浸潤的中性粒細胞中，見圖4B、C，還有少量表達在氣道上皮細胞。這提示血管的內(nèi)皮細胞和氣道上皮細胞也參與了VILI的形成。

Figure 3. Expression of NGAL protein in lung tissues, BALF and serum of mice after exposure to different strategy of mechanical ventilation detected by Western blotting. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsHV group.

圖3免疫印跡檢測不同通氣策略下小鼠肺組織、BALF及血清NGAL蛋白的表達

Figure 4. Location of NGAL expression in mouse lung tissues in the injurious mechanic ventilation model detected by immunohistochemistry. A:negative control; B and C: the intense expression of NGAL in vascular endothelial cells and infiltrating neutrophil (arrow) after injurious mechanic ventilation.

圖4免疫組織化學法檢測在損傷性通氣肺組織中NGAL的空間定位

討　　論

如今實驗研究中的大多數(shù)鑒別的生物標志物主要來源于血漿、血清、肺水腫液、BALF和呼氣冷凝液(exhaled breath condensate，EBC)。這些生物標志物可分為細胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等；肺上皮細胞的特異蛋白，如表面活性蛋白A、B、D(surfactant protein A、B、D，SP-A、SP-B、SP-D)；內(nèi)皮細胞激活的標記物，如黏附分子E-選擇素、L-選擇素等[5-6]。有臨床研究中發(fā)現(xiàn)SP-D在保護性通氣策略是明顯升高，而TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8卻明顯降低。TNF-α、IL-1β和IL-8具有促炎效應(yīng)，而IL-10、sTNFR1和sTNFR2具有抗炎的功能，IL-6和NO在不同的時空條件下具有抗炎或促炎的雙重效應(yīng)，并具有潛在的免疫調(diào)節(jié)功能。但無論是動物或是體外細胞實驗還是臨床實驗都發(fā)現(xiàn)這些蛋白的表達水平及其變化和潮氣量或呼氣末正壓有一定的相關(guān)性。因此，合理選擇通氣模式及參數(shù)調(diào)整是減少VILI的關(guān)鍵之一。目前臨床常用定容型和定壓型的2種通氣策略。小潮氣量(≤10 mL/kg)通氣是定容型通氣設(shè)置潮氣量的原則。壓力控制型通氣模式中一般認為平臺壓≤ 30 cmH2O可有效避免呼吸機相關(guān)的肺損傷，故設(shè)置的壓力通常在10～20 cmH2O，一般不超過30 cmH2O。我們的實驗選擇了臨床上最常見的2種通氣模式觀察到NGAL在損傷性通氣策略組升高顯著，高吸氣末峰壓組和大潮氣量通氣組NGAL mRNA和蛋白的表達明顯升高，提示NGAL是對機械刺激敏感的傳感蛋白，它可能參與了VALI的發(fā)病機制。

有關(guān)NGAL在VILI中的表達情況文獻報道較少。Yan等[7]對大鼠頸動脈損傷的動物模型研究中，分離血管平滑肌細胞并給予血管成形支架，機械刺激誘導急性期炎癥反應(yīng)的NGAL表達明顯增高，提示機械刺激也能誘導NGAL的表達。Friedl等[8]研究正常生長條件和給予促炎因子刺激后NGAL在上皮細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)NGAL在支氣管杯狀細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞表達，而且在炎癥肺的支氣管和肺泡上皮細胞表達增加。盡管NGAL在肺組織有表達，但是其與VILI相關(guān)的分子病理生理機制還不清楚。我們實驗中NGAL在VILI小鼠模型中的顯著表達提示NGAL可能是ALI發(fā)病機制中炎癥信號轉(zhuǎn)導蛋白。免疫組化的結(jié)果顯示NGAL表達位置在肺的上皮細胞，血管內(nèi)皮細胞和浸潤的中性粒細胞。這些結(jié)果強力支持NGAL在急性肺損傷(acute lung injury，ALI)炎癥過程中的重要性。這些結(jié)果也和近來報道的膿毒血癥時血循環(huán)中NGAL的濃度顯著升高，NGAL能抑制中心粒細胞凋亡的報道一致。

綜上所述，我們利用VILI小鼠動物模型發(fā)現(xiàn)NGAL可以作為判斷VILI新的潛在的生物標記物。在臨床工作中檢測血清或BALF中NGAL的水平，可能會為識別VILI高危病人提供依據(jù)。但是，NGAL在VILI發(fā)生機制中的作用還需要基因沉默或抗體阻斷等體外實驗進一步加以論證。

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