脂肪間充質(zhì)干細胞早期干預對野百合堿誘發(fā)的肺動脈高壓大鼠肺小動脈功能的影響*

梁敏烈，　謝良地，　李宏亮，　鄭蘇梨，　王華軍

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是指臨床上以肺血管阻力進行性升高，并最終導致右心室衰竭及死亡為特征的多種心肺疾病所共有的病理生理過程。近年來，國外的一些研究表明干細胞移植治療有助于改善肺血管的內(nèi)皮功能，降低肺動脈壓力并且改善肺小動脈的重構[1-3]。脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)是從脂肪組織中分離出的多潛能干細胞，具有自體來源豐富、取材方便、避免免疫排斥、多向分化等特點[4-6]，成為種子細胞研究的新熱點。近期，我們研究表明，歸巢于PAH模型大鼠體內(nèi)的ADMSCs能誘導分化為內(nèi)皮樣細胞[7]；而且，研究發(fā)現(xiàn)ADMSCs移植于野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導的PAH大鼠，可以減輕肺動脈壓力，同時改善肺小動脈的重構[8]。但是，ADMSCs移植對MCT誘發(fā)的PAH大鼠肺小動脈功能的影響目前尚未明確。因此，本研究采用ADMSCs早期移植于MCT誘導的PAH大鼠，觀察其肺小動脈的內(nèi)皮依賴性舒張(endothelium-dependent relaxation,EDdR)、非內(nèi)皮依賴性舒張(endothelium-independent relaxation,EDiR)以及收縮功能(vasoconstrictive function,VCF)的變化，旨在進一步探討ADMSCs在PAH治療中的作用。

材　料　和　方　法

1材料

1.1動物清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，5周齡，體質(zhì)量100～150 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號為SCXK(滬)20070005。動物飼養(yǎng)條件：每籠4只，恒溫(22±2)℃，恒濕(55±5)%，人工光照明暗各12 h/d，24 h自由攝食飲水。

1.2主要試劑牛血清白蛋白(Bovogen)；Ⅰ型膠原酶、DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gib-ico)；小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體(Abcam)；兔抗大鼠CD34單克隆抗體(Santa Cruz)；FITC標記山羊抗小鼠IgGⅡ抗和FITC標記山羊抗兔IgGⅡ抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；FITC anti-rat CD45、FITC anti-rat CD29和PE anti-rat CD90(Biolegend)；重組腺病毒載體Ad5-EGFP(北京正陽基因有限公司)；MCT、乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)阻斷劑左旋硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME) (Sigma)；硝普鈉(sodium nitroprusside, SNP)(北京雙鶴藥業(yè))；去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)(中國遠大醫(yī)藥有限公司)；氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈣(CaCl2)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、葡萄糖(glucose)和氫氧化鈉(NaOH)均為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1大鼠ADMSCs分離、培養(yǎng)、鑒定及熒光標記取清潔級5周齡雄性SD大鼠4只，頸椎脫臼處死，無菌條件下取雙側(cè)腹股溝區(qū)皮下脂肪，參照文獻[9-10]報道的方法進行大鼠ADMSCs的分離和培養(yǎng)。采用流式細胞儀(FACSCalibur型，BD)測定細胞表面抗原CD29、CD31、CD34、CD45和CD90表達的方法對傳代培養(yǎng)的ADMSCs進行鑒定。取生長良好的第3代ADMSCs，培養(yǎng)至細胞達50%融合時，加入感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為100的Ad5-EGFP重組腺病毒感染ADMSCs，24 h后更換新的培養(yǎng)基，72 h后熒光顯微鏡(PUSIX-70型，Olympus)觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達情況，并收集細胞備用。

2.2動物分組及動物模型的制備90只清潔級5周齡雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)2周(標準飼料，自由飲水)后按照隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組(control組,n=30)、MCT誘導組(PAH組,n=30)和MCT誘導+ ADMSCs早期干預組(ADMSCs-EI組,n=30)。實驗第1天，實驗動物根據(jù)本小組已建立的方法[11]，給大鼠腹腔一次性注射MCT 40 mg/kg復制PAH模型，對照組腹腔注射等量生理鹽水代替MCT；腹腔注射MCT后1周，ADMSCs-EI組大鼠經(jīng)左頸外靜脈一次性注射綠色熒光蛋白標記的1 mL ADMSCs (1×106)，對照組和PAH組經(jīng)左頸外靜脈一次性注射相同體積的生理鹽水。分別于ADMSCs移植后1、2、3周檢測各項指標。

2.3動物生存質(zhì)量觀察觀察實驗各組大鼠的活動、毛發(fā)、呼吸、食欲、體質(zhì)量等變化，隨訪動物的存活情況。

2.4肺動脈平均壓(mean pulmonary artery pressure, MPAP)測定參考孫波等[12]報道的方法，建立右心導管法測量大鼠MPAP[11]。大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后，從右頸外靜脈插管至肺動脈干，接壓力換能器和PowerLab生理信息采集與處理系統(tǒng)(ADInstruments)，待壓力波形穩(wěn)定后開始實時記錄肺動脈壓，取其平均值。

2.5離體肺小動脈環(huán)功能測定

2.5.1大鼠離體肺小動脈環(huán)的制備測壓后，迅速開胸取出大鼠肺葉，立即置于預先備好的、95% O2和5% CO2混合氣體飽和的4 ℃ Krebs液(mmol/L：NaCl 118.3，KCl 4.7，MgSO41.2，CaCl22.52，KH2PO41.2，NaHCO324.2，葡萄糖 11.0，10% NaOH滴定至pH 7.4)中，在體視顯微鏡下分離肺葉內(nèi)肺小動脈，取血管直徑介于100～200 μm的肺小動脈，用顯微外科剪去除血管周圍的脂肪及結(jié)締組織，將肺小動脈剪成3 mm的血管環(huán)，操作過程中避免過度牽拉，以防損傷內(nèi)皮。隨后用顯微外科鑷將肺小動脈血管環(huán)套于兩個直徑50 μm三角形鎢絲掛鉤上，其中一個連接張力換能器，連接記錄裝置(PowerLab生理信息采集與處理系統(tǒng))，另一個連接微調(diào)裝置以調(diào)節(jié)負荷張力。肺小動脈環(huán)分別置于持續(xù)通入95% O2+5% CO2混合氣體充分飽和、37 ℃恒溫的、10 mL Krebs液的四腔離體組織灌流系統(tǒng)(ADInstruments)浴槽中。實驗之前，肺小動脈環(huán)張力負荷0.5 g，每隔15 min 換1次Krebs液，平衡90 min。以高鉀Krebs液(含K+60 mmol/L)檢驗動脈環(huán)收縮性，收縮穩(wěn)定后，2次收縮幅度相差<10%則開始正式用于實驗。

2.5.2檢測大鼠離體肺小動脈環(huán)對不同濃度ACh、SNP和NE的張力變化反應(1)ACh誘導的EDdR：待肺小動脈血管環(huán)張力平衡后，用NE(1×10-5mol/L)預收縮引起最大收縮張力后，按濃度累積法向浴槽Krebs液中依次加入(1×10-10～1×10-4) mol/L的ACh，描記張力變化曲線。(2) SNP誘導的EDiR：待張力恢復至初始值，浴槽中先用eNOS抑制劑L-NAME(1×10-4mol/L)孵育30 min后，用NE(1×10-5mol/L)預收縮引起最大收縮張力后，按濃度累積法向浴槽Krebs液中依次加入(1×10-10～1×10-4)mol/L的硝普鈉，描記張力變化曲線。(3) NE誘導的收縮：待張力恢復至初始值，按濃度累積法向浴槽Krebs液中依次加入(1×10-10～1×10-5)mol/L的NE，描記張力變化曲線。

以上各步間隔均用37 ℃ Krebs液洗脫30～45 min，每隔15 min 換液1次，待張力恢復至初始值才進行下一步實驗。以上溶液、試劑均于實驗當天配制。EDdR和EDiR反應表示為血管舒張張力占NE(1×10-5mol/L)預收縮反應的百分比；誘導動脈環(huán)收縮反應的程度表示為血管收縮張力占NE(1×10-5mol/L)最大收縮反應的百分比，并計算濃度累積效應曲線的半數(shù)效應濃度(EC50)，收縮或舒張敏感性用 pD2值表示，即EC50以10為底的負對數(shù)值。

2.6熒光顯微鏡觀察分別于熒光標記的ADMSCs早期移植于大鼠后1、2、3周隨機各取ADMSCs-EI組大鼠1只，脫臼法處死后取肺組織做冰凍切片，熒光顯微鏡觀察ADMSCs 遷移及定植情況。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間差異應用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，量效關系數(shù)據(jù)采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

1大鼠ADMSCs培養(yǎng)、鑒定和熒光標記情況

大鼠ADMSCs原代培養(yǎng)6 h，可見細胞貼壁，呈小圓形，大小不等。2～4 d后細胞伸展，短梭形或小多角形，核呈橢圓形，較大，絕大部分細胞的生長呈現(xiàn)明顯的聚集性。1周后集落迅速增多，達到70%～80%融合，予以傳代培養(yǎng)。傳至第3代，可見細胞形態(tài)均一，梭形為主，胞漿豐富，核大,見圖1A。流式細胞儀檢測第3代ADMSCs表面標志，結(jié)果顯示細胞表達CD90和CD29陽性率分別為97.9%和86.6%，而CD34、CD45和CD31陽性率僅分別為37.9%、6.2%和0.9%。經(jīng)Ad5-EGFP重組腺病毒轉(zhuǎn)染ADMSCs，MOI為100時，第3天在熒光顯微鏡下可見所有ADMSCs均有綠色熒光信號，達到細胞移植標記要求，見圖1B。

Figure 1. The morphological characteristics and fluorescent labeling of cultured rat ADMSCs (×100).A: phase-contrast microscopic images of log-phase ADMSCs;B: GFP-labeled ADMSCs observed under fluorescence microscope. The transfection efficiency at MOI 100 was >90%.

圖1大鼠ADMSCs細胞形態(tài)及熒光標記

2GFP標記的ADMSCs在大鼠肺組織中的定植

GFP標記的ADMSCs經(jīng)頸外靜脈移植后遷移到肺循環(huán)中, 在早期移植后第1、2、3周，ADMSCs-EI組大鼠的肺組織經(jīng)冰凍切片熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，其血管壁均可見綠色熒光細胞分布，表明經(jīng)靜脈早期移植的ADMSCs均可以在大鼠肺組織中定植存活,見圖2。

Figure 2. GFP-labeled ADMSCs in lung tissue frozen sections observed under fluorescence microscope (×200). A1～3: fluorescence microscopic images of ADMSCs-EI group, 1, 2 and 3 weeks after early intervention of ADMSCs; B1～3: phase-contrast microscopic images of the same vision. Green fluorescent cells (white arrows) were located in lung vessels.

圖2GFP標記的ADMSCs定植于肺組織的熒光顯微鏡觀察

3動物生存質(zhì)量情況

腹腔注射野百合堿后1周，PAH組大鼠活動逐漸減少，毛發(fā)晦澀無光澤，呼吸急促，消瘦，體質(zhì)量下降或不增；對照組大鼠無上述改變。而PAH組大鼠癥狀進一步加重，其中2只實驗結(jié)束前近24 h未進食；ADMSCs-EI組大鼠食欲逐漸恢復，體重漸增加，呼吸平穩(wěn)，毛發(fā)有光澤，活動良好。實驗過程中各組動物均無死亡現(xiàn)象。

4ADMSCs早期移植對PAH模型大鼠MPAP的影響

與對照組相比，腹腔注射MCT后3、4周，PAH組大鼠MPAP呈時間依賴性升高(均P<0.05)；同時，與PAH組比較，ADMSCs早期移植后2、3周，ADMSCs-EI組大鼠MPAP顯著下降(均P<0.05)。在ADMSCs-EI組大鼠中，早期移植后3周與早期移植后1周比較，MPAP明顯增高(P<0.05)，見表1。

表1ADMSCs早期移植對大鼠肺動脈平均壓的影響

Table 1. Changes of mean pulmonary arterial pressure (MPAP) of rats 1,2 and 3 weeks after early transplantation of ADMSCs (mmHg. Mean±SD.n=10)

　　Group1week2weeks3weeksControl14．12±0．8214．68±0．9615．03±0．87PAH16．87±2．3926．95±0．89?△32．53±0．91?△ADMSCs?EI14．42±1．1516．37±0．94#18．26±1．41#△

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPAH group at the same time points;△P<0.05vs1 week in the same group.

5ADMSCs早期移植對PAH模型大鼠肺小動脈EDdR、EDiR以及VCF的影響

與對照組比較，腹腔注射MCT后2周，PAH組大鼠肺小動脈環(huán)對不同濃度ACh誘導的EDdR明顯減弱，其濃度-效應曲線明顯右移，pD2值明顯降低(P<0.05)；同時，與PAH組相比，ADMSCs早期移植后1周，ADMSCs-EI組大鼠肺小動脈環(huán)EDdR明顯改善(P<0.05)；但是，SNP誘導的EDiR和NE誘導的VCF在3組間無顯著差異(均P>0.05)。與對照組相比，腹腔注射MCT后3、4周，PAH組大鼠肺小動脈環(huán)的EDdR和EDiR呈顯著降低，其濃度-效應曲線顯著右移，pD2值顯著降低(均P<0.05)；同時，與PAH組相比，ADMSCs早期移植后2、3周，ADMSCs-EI組大鼠肺小動脈環(huán)EDdR和EDiR明顯改善(均P<0.05)；但是，NE誘導的VCF在3組間無顯著差異(均P>0.05)。在ADMSCs-EI組大鼠中，早期移植后3周與早期移植后1周比較，肺小動脈環(huán)的EDdR明顯減弱，其濃度-效應曲線明顯右移，pD2值明顯降低(均P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Effects of early transplantation of ADMSCs on pulmonary arteriolar EDdR, EDiR and VCF in MCT-treated rats. A～C: the pD2 values of EDdR, EDiR and VCF; D～F: the % relaxation of EDdR and EDiR, and the % contraction of VCF. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPAH group;☆P<0.05vsPAH group at 1 week;△P<0.05vsADMSCs-EI group at 1 week.

圖3ADMSCs早期移植對MCT模型大鼠肺小動脈EDdR、EDiR、VCF的影響

討　　論

本研究中我們觀察到MCT腹腔注射后2周, PAH組大鼠肺小動脈環(huán)的EDdR明顯減弱，而MPAP和肺小動脈環(huán)的EDiR、VCF沒有明顯變化，提示肺小動脈環(huán)的EDdR受損先于肺動脈壓力的增高。正常的肺血管舒縮功能依賴于肺血管內(nèi)皮的完整性，分子水平研究提示肺血管內(nèi)皮功能受損為肺動脈高壓關鍵始動因素，肺血管內(nèi)皮受損和功能障礙是肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。許多研究[13-15]發(fā)現(xiàn)，MCT誘導的肺動脈高壓，大鼠肺動脈對ACE的反應性下降，提示著內(nèi)皮功能受損導致了一氧化氮(nitric oxide, NO)合成、分泌下降，內(nèi)皮依賴的舒血管能力下降。本研究還觀察到MCT腹腔注射后3、4周， PAH組大鼠MPAP呈時間依賴性升高，同時肺小動脈環(huán)的EDdR和EDiR呈時間依賴性降低，但是VCF沒有明顯變化，提示MCT所致大鼠肺動脈壓力升高不僅與肺小動脈EDdR受損關系密切，同時還與EDiR密切相關。Muruyama等[16]研究發(fā)現(xiàn)，離體的肺小動脈環(huán)同時對硝普鈉的舒張反應下降，說明MCT誘導PAH大鼠肺血管舒張功能的損傷不僅限于內(nèi)皮依賴的血管舒張，可能與NO血管舒張作用下游效應有關，包括細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷的合成與分解，肺動脈平滑肌細胞內(nèi)游離鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)異常等。本研究小組前期研究發(fā)現(xiàn)MCT誘導PAH大鼠的肺動脈血管重構時，肺動脈平滑肌細胞存在鈣離子通道的電壓門控鈣通道α1C亞單位、蘭尼定受體3、肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-Mg2+ATP酶泵2a 及三磷酸肌醇受體1 mRNA和蛋白表達異常[17]。另外，Khan等[18]采用MCT誘導的PAH模型大鼠，一次腹腔注射MCT 60 mg/kg，3周后檢測離體葉外型肺動脈環(huán)收縮功能，結(jié)果顯示葉外型肺動脈環(huán)對去甲腎上腺素誘導的收縮反應減弱，并認為與Rho激酶活化偶聯(lián)障礙有關。而本研究尚未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，考慮主要可能與所研究的肺動脈部位不同有關。

本研究結(jié)果顯示，GFP標記的ADMSCs早期經(jīng)頸外靜脈移植后1、2、3周均可以在MCT誘導PAH模型大鼠的肺組織血管壁中定植存活。ADMSCs早期移植MCT誘導PAH模型大鼠后1周，其肺小動脈環(huán)的EDdR較PAH組有明顯改善；ADMSCs早期移植后2、3周，其MPAP及肺小動脈環(huán)的EDdR、EDiR均較PAH組有顯著改善。實驗動物移植ADMSCs后，生存狀況明顯改善，食欲漸漸恢復，毛發(fā)有光澤，活動良好。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，歸巢于PAH模型大鼠體內(nèi)的ADMSCs能誘導分化為內(nèi)皮樣細胞,并認為ADMSCs對血管內(nèi)皮有修復功能[7]。脂肪干細胞具有很強的自我增殖能力。在特定的條件下，可以誘導分化為多種組織細胞[19-20]。同時，脂肪干細胞具有一定的旁分泌能力，可以分泌具有生物活性的血管內(nèi)皮生長因子、肝細胞生長因子等多種促血管生長因子, 促進新生血管形成，加速內(nèi)皮細胞的生長,修復損傷的內(nèi)皮[21-22]。何志旭等[23]研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞移植后可通過形成新生血管建立側(cè)枝循環(huán)，有效減輕野百合堿誘導的肺動脈高壓和肺組織病變程度。Liu等[24]報道了ADMSCs治療利用動靜脈分流的方法建立的肺高血流量誘導的PAH模型大鼠。分流術造模12周后，給予大鼠靜脈注射5×107ADMSCs，細胞移植2周后，結(jié)果顯示，細胞移植的PAH大鼠血流動力學異常和右心室肥厚發(fā)生逆轉(zhuǎn)，肺小動脈重塑改善；同時，HGF和eNOS表達增強，肺血管床數(shù)量增加，改善肺血管阻力。本課題組前期采用ADMSCs治療MCT誘導的PAH模型大鼠，一次腹腔注射MCT 40 mg/kg，2周后給予ADMSCs治療，結(jié)果顯示肺動脈壓力明顯降低且肺小動脈重塑明顯改善[8]。同時研究發(fā)現(xiàn)，ADMSCs降低肺動脈壓力可能與鈣離子通道變化有關[25]。另外，本課題組研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織基質(zhì)血管組分移植可明顯改善阿霉素誘導的心力衰竭大鼠心功能，部分機制可能與促進心肌組織血管再生有關。因此，我們有理由認為ADMSCs移植治療可以修復受損的內(nèi)皮，并改善內(nèi)皮依賴與非內(nèi)皮依賴的舒血管作用及分泌舒血管因子，調(diào)節(jié)血管張力和促進血管新生。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)在ADMSCs-EI組大鼠中，早期移植后3周與早期移植后1周比較， MPAP仍是升高，肺小動脈環(huán)的EDdR仍是減弱，因此，我們推測ADMSCs早期干預，僅是延緩MCT誘導的肺動脈高壓和肺小動脈血管功能損害的進展。因此，目前關于ADMSCs移植的最佳時機仍需要進一步研究。

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