櫸樹無菌播種技術

張日清，劉海龍,2，汪靈丹，金曉玲

（1.中南林業(yè)科技大學a.林學院；b.風景園林學院，湖南 長沙 410004；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院，廣西 南寧 530002）

櫸樹Zelkova schneideriana屬于榆科櫸屬，落葉大喬木，國家二級保護植物，分布于我國淮河流域、秦嶺以南的長江中下游地區(qū)。櫸樹木材致密堅硬，材色鮮艷，紋理美觀，耐腐性強，是生產(chǎn)各類高檔家具和工藝品的上等木材。同時由于其樹形優(yōu)美，樹冠冠幅大，葉色季相變化豐富，也是深受人們喜愛的傳統(tǒng)色葉園林風景樹種[1-3]。

櫸樹的繁殖分為有性繁殖和無性繁殖。目前生產(chǎn)上常用的有性繁殖是種子繁殖。無性繁殖主要有嫁接、扦插和組織培養(yǎng)[4]。通過種子無菌播種可以快速獲取無菌活體，作為室內(nèi)快繁的一條途徑，已在眾多植物上得到成功應用[5-6]。

雖然前人已在櫸樹組培技術上做了較多的研究，但是目前尚未見櫸樹無菌播種技術的相關研究報道。筆者研究不同的處理方法和不同的播種基質(zhì)對櫸樹種子萌發(fā)生長的影響，以期找到較適宜的櫸樹無菌播種方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于播種的第1批櫸樹種子采集于2011年11月中旬，采集地點為湖南懷化，千粒質(zhì)量約為15.4 g，冰箱4 ℃貯藏至2012年3月中旬進行無菌播種，播種時種子呈咖啡色。

用于播種的第2批櫸樹種子采集于2012年10月下旬，采集地點為廣西百色，千粒質(zhì)量約為16.5 g，冰箱4 ℃貯藏至2012年11月上旬進行無菌播種，播種時種子呈綠色。

1.2 試驗方法

種子分剝殼和不剝殼2種處理，剝殼處理的種子播種到培養(yǎng)基上，不剝殼的種子播種到沙子中。培養(yǎng)過程中仔細觀察，記錄出現(xiàn)萌動的初始時間，播種后60 d時統(tǒng)計萌發(fā)率。

1.2.1 剝殼種子處理方法

將種子在純凈水中浸泡24 h后用純凈水沖洗3～4次，將種子放置在干凈的培養(yǎng)皿上，用手小心剝除種殼。在超凈工作臺內(nèi)用0.1%的升汞處理剝殼后的種子5 min，用無菌水沖洗干凈后接種到培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基裝在試管中，每顆種子單獨接1根試管，每種處理的培養(yǎng)基播100管，重復2次。

培養(yǎng)基配方如下：

①改良MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA＋位瓊脂4.0 g/L＋蔗糖30 g/L＋抗壞血酸0.01 g/L；

②改良MS＋2.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L NAA＋瓊脂4.0 g/L＋蔗糖30 g/L＋抗壞血酸0.01 g/L；

③改良MS＋2.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L 2,4-D＋瓊脂4.0 g/L＋蔗糖30 g/L＋抗壞血酸0.01 g/L；

④改良MS＋2.0 mg/L 6-BA＋瓊脂4.0 g/L＋蔗糖30 g/L＋抗壞血酸0.01 g/L。

培養(yǎng)基pH值均調(diào)整為5.8。

1.2.2 不剝殼種子處理方法

將種子在純凈水中浸泡24 h后用純凈水沖洗3～4次。在超凈工作臺內(nèi)用75%的酒精浸泡30 s，再用0.1%的升汞處理15 min，用無菌水沖洗干凈后接種到沙子中。沙子為篩過的干沙，在玻璃瓶中經(jīng)高溫高壓（121 ℃，0.11 MPa）滅菌約50 min。種子播種到沙子后，在超凈工作臺內(nèi)向瓶中倒入無菌水，將沙子淋透，再深埋種子。每瓶播入種子20顆，1次播種5瓶，重復2次。培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，光照2 000 lx，光照時間為每天12 h。

2 結果與分析

2.1 第1批種子不同處理萌發(fā)狀況

第1批種子不剝殼播種到沙子中，60 d后觀察未發(fā)現(xiàn)萌發(fā)。剝殼處理后分別播種到①、②、③3種培養(yǎng)基中約10 d發(fā)現(xiàn)部分種子開始愈傷化，30 d后統(tǒng)計，愈傷組織的誘導率約為5%。種子在3種培養(yǎng)基上的愈傷誘導率無顯著差異，但在培養(yǎng)基②、③上產(chǎn)生愈傷組織比培養(yǎng)基①上早。每間隔30 d將愈傷組織周轉(zhuǎn)1次，進行增殖。在培養(yǎng)基①上增殖的愈傷組織不易褐化，愈傷組織呈深黃色（見圖1a）。愈傷組織繼代增殖數(shù)代后可轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)，在培養(yǎng)基④上可取得較好的分化效果，愈傷組織上先出現(xiàn)多個白色小芽點，后轉(zhuǎn)為綠色（見圖1b），最后從芽點分化出芽，部分芽能抽高到1.0 cm以上（見圖1c），便可剪切出來誘導生根。

圖1 第1批種子的處理效果Fig.1 Effect of lab treatment on the first batch of seeds

2.2 第2批種子不同處理萌發(fā)狀況

第2批種子不剝殼播種到沙子中，7 d后發(fā)現(xiàn)有芽萌發(fā)（見圖2a），60 d后統(tǒng)計，發(fā)芽率為14%。芽抽高至3～4 cm后轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基①上培養(yǎng)，芽能繼續(xù)抽高并展葉（見圖2b）。培養(yǎng)基上培養(yǎng)約1周后發(fā)現(xiàn)約46.4%的芽帶菌污染，其它不帶菌芽可轉(zhuǎn)入繼代增殖。第2批種子剝殼處理后分別播種到①、②、③3種培養(yǎng)基上,10 d后發(fā)現(xiàn)種子萌動，胚乳（子葉）變綠膨大并展開（見圖2c）。培養(yǎng)基①上的芽可抽高展葉（見圖2d），培養(yǎng)基②、③上萌動的種子僅有胚乳（子葉）膨大變綠，但不能抽高生長，約15 d左右發(fā)現(xiàn)胚乳（子葉）愈傷化（圖2e），30 d后種子已完全變成愈傷團（見圖2f）。60 d后統(tǒng)計在培養(yǎng)基上出現(xiàn)萌動的種子所占比率為12.7%。

圖2 第2批種子的處理效果Fig.2 Effect of lab treatment on the second batch of seeds

3 結論與討論

前人已成功利用櫸樹的胚、頂芽、子葉、下胚軸、莖段等外植體獲得櫸樹無菌活體，并最終形成再生植株[7-8]。金曉玲等發(fā)現(xiàn)了櫸樹組織誘導、繼代和生根培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基[4]。但利用櫸樹種子作為外植體，通過無菌播種的方法來獲得無菌活體尚未見報告。種子無菌播種有自身的優(yōu)勢，一是可實現(xiàn)全年全天候的播種，二是其消毒效果不受季節(jié)和天氣的影響。結合課題組前期對櫸樹優(yōu)良種源選擇的研究，采用優(yōu)良種源的種子進行無菌播種，則獲得的組培苗可直接應用于生產(chǎn)。

本研究中所采用的種子發(fā)芽率僅有14%，遠低于李鐵華等報道的80%以上，而冰箱4℃貯藏4個月的第1批種子甚至未發(fā)現(xiàn)發(fā)芽，究其原因，可能是種子本身的質(zhì)量問題或與消毒處理對種子的傷害有關。前人的研究結果表明：冰箱3 ℃貯藏能較好地保持櫸樹種子活力，貯藏18個月，仍能保持77.5%的發(fā)芽率[9]。而用質(zhì)量濃度為150 g/L的PEG處理已常溫貯藏12個月的櫸樹種子36 h，還可大幅恢復和提高種子活力[10]。這些研究結果對于指導如何儲存和處理櫸樹種子有重要意義，筆者將繼續(xù)優(yōu)化種子處理、儲存、消毒等各個環(huán)節(jié)，以獲得更高的無菌播種發(fā)芽率。

第1批種子與第2批種子在相同的處理條件下，發(fā)芽率存在較大差異，表明2批種子的質(zhì)量存在較大差異。第2批為新采集的種子，種子活力強，及時播種能獲得較高的發(fā)芽率，放置過一段時間的第1批種子活力明顯下降。

第1批種子剝殼后播種到3種不同培養(yǎng)基上，愈傷組織的誘導率并無顯著差異。表明愈傷組織的產(chǎn)生不僅受培養(yǎng)基的影響，還與種子本身的狀態(tài)有較大關系。種子活力的下降或者種胚的發(fā)育不全或許是導致種子不萌發(fā)而直接產(chǎn)生愈傷組織的原因。培養(yǎng)基①上的愈傷組織不易褐化，表明含有較低濃度激素的培養(yǎng)基有利于愈傷組織的增殖。

第2批種子在沙子中和在培養(yǎng)基中可以獲得相似的發(fā)芽率，但是播種在沙子中的種子萌發(fā)時間要早2～3 d。同時還發(fā)現(xiàn)沙子中萌發(fā)出的芽，其真葉在種子萌發(fā)后15 d就能迅速展開，而在培養(yǎng)基中萌發(fā)的芽，其真葉在種子萌發(fā)后40 d后仍然較小，未能展開生長。表明沙子比培養(yǎng)基也許能提供更為合適的溫濕等條件，有利于種子的萌發(fā)和芽的生長。

第2批種子剝殼后播種到3種不同培養(yǎng)基上均出現(xiàn)芽的萌動。在培養(yǎng)基①上，萌動出的芽能抽高展葉。而在培養(yǎng)基②、③上種子出現(xiàn)先萌動后愈傷化的現(xiàn)象。表明含有高濃度激素的培養(yǎng)基易誘導愈傷的產(chǎn)生，但作用發(fā)生在種子萌動以后，種子在前期仍受自身內(nèi)源激素調(diào)節(jié)。

參考文獻：

[1]張日清,楊 婕,金 曉 玲. Dynamic activity of endogenous plant hormones inZelkova schneiderianaduring the growth of seedlings[J]. 經(jīng)濟林研究,2011,29(4):1－5.

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[3]汪靈丹,張日清,金曉玲. 外植體的選擇和消毒對大葉櫸組織培養(yǎng)的影響[J]. 湖南林業(yè)科技,2008,35(2):21－23.

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[7]汪靈丹,張日清,金曉玲. 大葉櫸頂芽誘導與增殖培養(yǎng)[J]. 中南林業(yè)科技大學學報,2010,30(6):75－79.

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[10]李鐵華,文仕知,喻勛林,等. 聚乙二醇(PEG)滲調(diào)處理恢復和提高櫸樹種子活力的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(3):887－888.