藥用百合組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

金亞征，俞鳳芳，車瑞香，張榮梅 ，丁麗梅 ，方 華

（1.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；2.廊坊市農(nóng)業(yè)局，河北 廊坊 065000；3.河北省衡水市園林管理局，河北 衡水 053000；4.北京市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校順義區(qū)分校，北京 101300）

藥用百合屬于百合科Liliaceae百合屬LiliumL.植物，是集觀賞、食用、藥用為一體的多年生草本植物。其花美麗清雅，芳香宜人；其鱗莖是一種極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的保健品,具有很高的藥用價(jià)值，可以活血祛瘀、消腫止痛、養(yǎng)血安神，養(yǎng)陰潤(rùn)肺止咳，還能治療和預(yù)防糖尿病等疾病[1]。常規(guī)的百合繁殖方法為分球繁殖，因其存在繁殖系數(shù)低、種球數(shù)量有限、再次感染病毒的機(jī)率高等問(wèn)題，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足藥用百合商品化生產(chǎn)的需求。而利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行繁殖，既能縮短繁殖周期，增加繁殖系數(shù)，又能減少病毒侵害機(jī)率。目前對(duì)食用和觀賞性百合來(lái)說(shuō)，以其鱗片、葉片、莖段、珠芽、花柱、子房和花絲等組織和器官作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究均有報(bào)道[2-3]，其中以鱗片離體培養(yǎng)的繁殖效果最好，成功率最高，所以應(yīng)用最為廣泛[4-7]。文中利用藥用百合鱗片作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，研究了藥用百合組織培養(yǎng)中鱗莖的誘導(dǎo)、增殖、生根等關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題，以求找到最佳的離體培養(yǎng)配方，大幅度提高繁殖系數(shù)，為藥用百合的商品化快繁生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和地點(diǎn)

試驗(yàn)材料：藥用百合的當(dāng)年生子鱗莖。

試驗(yàn)地點(diǎn)：河北北方學(xué)院園藝組織培養(yǎng)研究中心。

1.2 研究方法

1.2.1 培養(yǎng)基

采用MS培養(yǎng)基，再添加不同種類、不同濃度配比的激素。

鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS＋6-BA 0.2～1.0 mg·L-1＋NAA 0.2～0.8 mg·L-1。

增殖培養(yǎng)基：MS＋6-BA 0.2 mg·L-1＋NAA 0.2～1.0 mg·L-1，MS＋6-BA 0.2 mg·L-1＋ 2,4-D 0.2 ～ 1.0 mg·L-1。

生根培養(yǎng)基：1/2MS＋I(xiàn)AA 0.1～0.5 mg·L-1，1/2MS＋NAA 0.1～0.5 mg·L-1。

1.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為1 000～2 000 lx，光照時(shí)間為每天12 h。

1.2.3 鱗莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)

選擇新鮮、潔白、無(wú)病斑的當(dāng)年生子鱗莖（直徑為1.5～2.0 cm），洗凈泥土，剝?nèi)≈虚g層鱗片作為試材。將鱗片用流動(dòng)的清水洗凈泥土，并沖洗5 h，再放入無(wú)菌操作室的超凈工作臺(tái)，用藥物進(jìn)行消毒處理，具體的處理方法[2]如下：將洗凈的鱗片用75%的酒精浸泡40 s，用無(wú)菌水沖洗5 次，再用0.1%的升汞滅菌處理10 min，然后用無(wú)菌水沖洗5 次，用滅過(guò)菌的濾紙吸干表面水分；小鱗片不進(jìn)行切割處理，直接進(jìn)行接種，且將小鱗莖的內(nèi)側(cè)朝上，成45°角插入培養(yǎng)基中，插入的深度為小鱗片的1/3～1/2。

激素配方采用NAA和6-BA的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共15個(gè)處理，處理1到處理15培養(yǎng)基BA的濃度分別是：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1，處理1到處理15培養(yǎng)基NAA的濃度分別是：0.2、0.2、0.2、0.2、0.2、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.8、0.8、0.8、0.8、0.8 mg·L-1；每個(gè)處理設(shè)4 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8瓶培養(yǎng)基，每瓶接入3個(gè)小鱗片。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果并按如下公式計(jì)算誘導(dǎo)率：

小鱗莖誘導(dǎo)率（%）＝分化鱗莖的鱗片總數(shù)／接種鱗片總數(shù)×100。

1.2.4 鱗莖的增殖培養(yǎng)

待誘導(dǎo)出的小鱗莖芽長(zhǎng)到2.0～4.0 cm時(shí)，將其分為單株進(jìn)行增殖培養(yǎng)。基本培養(yǎng)基為MS，激素配方采用BA和2,4-D；6-BA和NAA的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共10個(gè)處理，處理1到處理10的培養(yǎng)基里BA的濃度均為0.2 mg·L-1；處理1到處理5的培養(yǎng)基不加2,4-D，NAA的濃度分別為：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1；處理 6到處理10的培養(yǎng)基不加NAA，2,4-D的濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8瓶培養(yǎng)基，每瓶接入單株3株。然后在無(wú)菌條件下進(jìn)行增殖試驗(yàn)，45 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果并按如下公式計(jì)算增殖率：

鱗莖增殖率（%）＝增殖的芽數(shù)/接種的總芽數(shù)×100。

1.2.5 鱗莖的生根培養(yǎng)

待增殖培養(yǎng)所得的鱗莖長(zhǎng)至4.0 cm左右時(shí)，分成單株進(jìn)行生根培養(yǎng)。基本培養(yǎng)基為1/2MS，激素配方采用IAA和NAA的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共10個(gè)處理，處理1到處理5的培養(yǎng)基不加NAA，IAA的濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1；處理6到處理10的培養(yǎng)基不加IAA，NAA的濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8瓶培養(yǎng)基，每瓶接入單株3株。然后在無(wú)菌條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

結(jié)果調(diào)查：鱗莖生根率（%）=生根的株數(shù)/接種的總株數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方對(duì)藥用百合鱗莖誘導(dǎo)分化的影響

經(jīng)觀察，接種15 d后鱗片漸漸變綠，鱗片內(nèi)側(cè)分化出一些黃綠色的凸起，20 d后這些小凸起便分化成了小鱗莖，50 d后長(zhǎng)出小葉，小鱗莖生長(zhǎng)很快，60 d后可長(zhǎng)成小苗。不同培養(yǎng)基配方對(duì)藥用百合鱗莖誘導(dǎo)分化的影響如表1 所示。從表1可以看出，BA和NAA對(duì)藥用百合鱗莖誘導(dǎo)有顯著的促進(jìn)作用，15種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)出鱗莖，經(jīng)方差分析表明，配方10即MS＋1.0 mg·L-1BA＋0.5 mg·L-1NAA的誘導(dǎo)率顯著高于其他處理，且誘導(dǎo)率達(dá)78.1%，每塊鱗片的平均鱗莖數(shù)最多，達(dá)3.6個(gè)。圖1顯示了藥用百合鱗莖誘導(dǎo)分化的情況。

2.2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)藥用百合鱗莖增殖的影響

待初代培養(yǎng)的鱗莖長(zhǎng)到2.0～4.0 cm時(shí)，將其分為單株，移入表2所列培養(yǎng)基中，13 d后芽基部開(kāi)始出現(xiàn)新生小芽，逐漸形成芽叢，45 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。不同培養(yǎng)基配方對(duì)藥用百合鱗莖增殖的影響如表2所示。從表2可以看出，BA加NAA或BA加2,4-D對(duì)藥用百合小鱗莖增殖有顯著促進(jìn)作用，10種培養(yǎng)基均可增殖，經(jīng)方差分析，配方3（MS＋0.2 mg·L-16-BA＋0.6 mg·L-1NAA）和配方7（MS＋0.2 mg·L-16-BA＋0.4 mg·L-12,4-D）的芽增殖率顯著高于其他處理，且增殖率達(dá)到了90.6%和93.7%。圖2顯示了藥用百合鱗莖的增殖情況。

表1 不同培養(yǎng)基配方對(duì)藥用百合鱗莖誘導(dǎo)分化的影響?Table 1 Effect of different medium formulations on bulb induction and differentiation in medicinal lily

表2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)藥用百合鱗莖增殖的影響?Table 2 Effect of different medium formulations on bulb propagation in medicinal lily

圖1 鱗莖誘導(dǎo)分化情況Fig.1 Bulb formation and differentiation status in medicinal lily

圖2 鱗莖增殖情況Fig.2 bulblet proliferation status of medicinal lily

由表2還可以看出，在6-BA濃度不變的情況下，相同濃度的2，4-D較NAA更有利于小鱗莖的增殖，且增殖鱗莖的質(zhì)量也好。故認(rèn)為最適的鱗莖增殖培養(yǎng)基為7號(hào)。

2.3 不同培養(yǎng)基配方對(duì)藥用百合鱗莖生根的影響

待增殖培養(yǎng)所得的鱗莖長(zhǎng)至4.0 cm左右時(shí)，分成單株，接入生根培養(yǎng)基中，觀察不同培養(yǎng)基配方對(duì)生根的影響，不同培養(yǎng)基配方對(duì)藥用百合鱗莖生根的影響如表3所示。從表3可以看出：10種培養(yǎng)基配方的生根率均都很高，但根系生長(zhǎng)情況不同，1/2MS＋0.1～0.5 mg·L-1IAA根系生長(zhǎng)都很細(xì)弱，無(wú)根毛產(chǎn)生。1/2MS＋0.1～0.5 mg·L-1NAA，不但生根率高而且根系比較壯，大部分有根毛產(chǎn)生。配方7（1/2MS＋0.2 mg·L-1NAA）的生根效果最好，其平均生根數(shù)達(dá)6.3條，且根粗壯，根毛較多，適于移栽?？傊?，較高濃度的生長(zhǎng)素不利于根的誘導(dǎo)，NAA誘導(dǎo)藥用百合生根的平均時(shí)間較IAA短7.5 d左右，相同濃度的NAA較IAA更有利于根的誘導(dǎo)。圖3、圖4為藥用百合根系的分化、生長(zhǎng)情況。

表3 不同培養(yǎng)基配方對(duì)藥用百合鱗莖生根的影響?Table 3 Effect of different medium formulations on bulb rooting in medicinal lily

圖3 根系分化情況Fig.3 Root system differentiation status

圖4 根系生長(zhǎng)情況Fig.4 Root system growth status

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果1即試驗(yàn)一的配方10（MS＋1.0 mg·L-16-BA＋0.5 mg·L-1NAA）是藥用百合最適宜的鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。前人研究中所用的鱗片大都是成熟的鱗莖[8]，并經(jīng)過(guò)低溫處理解除休眠的，切取鱗片的中下部作為外植體[9]，本試驗(yàn)所用的外植體是從正在生長(zhǎng)的植株上采集的當(dāng)年生子鱗莖（直徑約1.5～2.0 cm）上的小鱗片,不經(jīng)過(guò)切塊，直接插入培養(yǎng)基。這種方法省去了鱗莖低溫處理過(guò)程，不用切割，操作簡(jiǎn)單，而且新生的子鱗莖非常干凈，消毒容易。

本試驗(yàn)結(jié)果2即試驗(yàn)二的配方3（MS＋6-BA 0.2 mg·L-1＋NAA 0.5 mg·L-1）或試驗(yàn)二的配方7（MS ＋ 6-BA 0.2 mg·L-1＋ 2,4-D 0.4 mg·L-1）是藥用百合鱗莖增殖最適宜的培養(yǎng)基配方。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究具有相似之處，即NAA和2,4-D對(duì)小鱗莖的增殖具有明顯的促進(jìn)作用,但隨著濃度的不斷升高，小鱗莖增殖率明顯下降[10]。

本試驗(yàn)結(jié)果3即試驗(yàn)三的配方7（1/2MS＋NAA 0.2 mg·L-1）是藥用百合芽生根的最適宜的培養(yǎng)基配方。與前人也有相似之處：一般的生根培養(yǎng)用1/2MS 培養(yǎng)基,并附加NAA[11]。本試驗(yàn)用1/2MS 培養(yǎng)基并附加NAA，誘導(dǎo)出的根短且粗壯，有根毛，移栽后易成活；而用1/2MS 培養(yǎng)基并附加IAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的根長(zhǎng)且細(xì)弱，無(wú)根毛，移栽后成活率低，說(shuō)明NAA誘導(dǎo)生根的效果要好于IAA。

綜上所述，藥用百合鱗莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方是 MS＋6-BA1.0 mg·L-1＋ NAA0.5 mg·L-1；藥用百合小鱗莖增殖最佳的培養(yǎng)基配方是MS＋6-BA 0.2 mg·L-1＋ NAA 0.6 mg·L-1和 MS ＋6-BA 0.2 mg·L-1＋ 2,4-D 0.4 mg·L-1；藥用百合小鱗莖生根的最佳的培養(yǎng)基配方是1/2MS＋NAA 0.2 mg·L-1。

參考文獻(xiàn)：

[1]郭朝暉,蔣生祥.中藥百合的研究和應(yīng)用[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2004,(3):85－88.

[2]蔣細(xì)旺,司懷軍.百合的組織培養(yǎng)技術(shù)綜述[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(1):78－82.

[3]關(guān)文靈,李葉芳,楊 德,等.云南大百合花器官的組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].西部林業(yè)科學(xué),2009,38(2):12－16.

[4]李冰華,金曉玲,劉雪梅,等.香水百合鱗片組織培養(yǎng)再生體系的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(4):83－85.

[5]鄒迎春,覃大吉,魏代俊,等.東方百合組培快繁技術(shù)研究[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2009,27(4):448－451.

[6]張利萍.新鐵炮百合的組織快繁技術(shù)研究[J].防護(hù)林科技,2010,(6):29－30.

[7]PAN You-zhao,ZHAO Yu-ying. Different Explants ofLilium lancifoliumHave Different Potential to Differentiate and Regenerate in Tissue Culture[J]. Agricultural Science &Technology,2011,12(10):1437－1440.

[8]陳為民,宋為民.卷丹和青島百合的組織培養(yǎng)及植株分化[J].植物生理,1982,(2):352－358.

[9]王 剛,杜 捷. 蘭州百合和野百合組織培養(yǎng)及快速繁殖研究[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào),2002,38(1):692－695.

[10]孟 楊,潘佑找,賈姍姍,等.湖北百合的組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(17):447－ 450.

[11]趙祥云,程 謙,邢尤美,等. 百合珠芽組培及脫毒研究[J].園藝學(xué)報(bào),1993,20(3):284－288.