抗諾氟沙星單克隆抗體的制備及其性質(zhì)的研究

徐田麗 蘇國成 江曉穎 孫雪珂 江峰

摘要：為了監(jiān)測諾氟沙星抗生素的濫用，我們開發(fā)了一種基于單克隆抗體的酶聯(lián)免疫方法。將小分子抗原諾氟沙星NOR通過碳二亞胺法與載體蛋白BSA、OVA進行偶聯(lián)。得到完全抗原NORBSA和NOROVA。用NORBSA對3只雌性小鼠進行免疫后，利用細胞融合技術(shù)制備雜交瘤細胞，用間接ELISA法和間接競爭ELISA法篩選陽性細胞進行克隆，得到3株穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細胞株，分別命名為7C4，8G3，11G7。檢測細胞的上清液和純化后的腹水效價，分別為1：512，1：1024，1：1024和1：128000，1：128000，1：128000。對三株細胞的亞型鑒定為IgG2b，IgG2b，IgG1。建立的標(biāo)準(zhǔn)競爭曲線計算得IC50值為31.225 ng，其檢測線性范圍為 5.011630.95 ng/mL，最低檢出量為2.75 ng。親和力常數(shù)Kaff為4.6×108。諾氟沙星單克隆抗體與環(huán)丙沙星（27.22%）、恩諾沙星（11.29%）、奧比沙星（11.03%）、氧氟沙星（9.73%）、達氟沙星（7.38%）、沙拉沙星（2.57%）、二氟沙星（0.61%）幾種抗菌藥有較低的交叉反應(yīng)率。

關(guān)鍵詞：諾氟沙星；單克隆抗體；間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗；性質(zhì)

Abstract： To monitor the abuse of Norfloxacin （NOR）， developing a monoclonal antibody （mAb） based enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） is our future goal.The small molecule antigen NOR was conjugated with BSA and OVA proteins by EDC method.Then NORBSA conjugate and NOROVA can be obtained.Three female mice were immunized by NORBSA conjugate.And the hybridoma cell lines were obtained by cell fusing technology.Positive cells were screened by indirect ELISA and indirect competitive ELISA.Finally， three hybridoma cell lines named 7C4， 11G7 and 8G3 were screened out.The titer of cell culture supernatant and the ascites titer after purification of three hybridoma cell lines were 1：512， 1：1024， 1：1024 and 1：128000， 1：128000，1：128000 respectively.The subtypes of three cells were IgG2b， IgG2b， IgG1.The competition standard curve was developed by indirect ELISA， the half maximal inhibitory concentration（IC50） was 31.225 ng， the detection of linear range was 5.011 ng ～ 630.95 ng， and the detection limit was 2.75 ng.The affinity constant Kaff was 4.6×108.There have low crossreactivity between ciprofloxacin （27.22%）， enrofloxacin （11.29%）， orbifloxacin （11.03%）， ofloxacin （9.73%）， danofloxacin （7.38%）， sarafloxacin （2.57%）， difloxacin （0.61%） antimicrobial agents.

Key words：Norfloxacin；Monoclonal antibody；Indirect competitive ELISA；Characterization

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活水平提升了許多，對于肉、蛋、奶及相關(guān)副食品的數(shù)量和質(zhì)量也提出了更高的要求。獸藥在保障動物性食品供應(yīng)上，發(fā)揮著不可替代的作用[1]。氟喹諾酮類原料藥（FQs）是第三代合成抗生素，其具有光譜抗菌性，廣泛用于在畜牧業(yè)和人類的各種疾病的預(yù)防和治療[2]。由于他們可以進入食物鏈和導(dǎo)致細菌的耐藥性，而對人類的健康存在潛在的危險。諾氟沙星（NOR）是一種合成氟喹諾酮類抗生素，通過破壞消化道內(nèi)致病細菌的DNA螺旋酶，防止細菌DNA復(fù)制，因此達到抗菌性，針對許多致病性革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，包括耐慶大霉素、綠膿假單胞菌和抗藥性金黃色葡萄球菌[3]。NOR廣泛用于治療呼吸道和尿路感染、眼睛和皮膚感染、腹瀉等[4]。盡管如此，NOR作為臨床上重要的應(yīng)用藥物，它會導(dǎo)致一些副作用，例如頭痛、頭暈、惡心和嘔吐[5]。鑒于他們的毒性和副作用，歐盟、美國、日本，和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和中國建立了FQs在不同動物食品中的最大殘留量[6]。歐盟通過歐共體理事會條例，規(guī)定恩諾沙星（環(huán)丙沙星）的最大殘留量100ug/kg，氟甲醛的最大殘留量為50ug/kg，馬波沙星為75ug/kg，達氟沙星為35ug/kg（03/2004）[7]。目前，氟喹諾酮類藥物殘留的主要檢測方法有：微生物法[8]，高效液相色譜法（HPLC）[9]，免疫分析法[10]，超高效液相色譜質(zhì)譜連用法（LCMS）[11]，高效毛細管電泳法（HPCE）[12]，化學(xué)發(fā)光分析法（CL）[13]，酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）[14]，免疫熒光測定法（IFA）[15]，免疫親和色譜法（IAC）[16]，及膠體金免疫測定法（CGIA）[17]等。近年來，酶聯(lián)免疫吸附試驗已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境和農(nóng)業(yè)方面進行微量殘留的篩選分析。相比其他方法，ELISA 需要更少的時間和樣品準(zhǔn)備，且適用于廣大基層檢測單位現(xiàn)場檢測。ELISA試劑盒的研發(fā)也為喹諾酮類藥物的殘留監(jiān)測提供了更大的方便。免疫學(xué)分析方法是基于抗原抗體特異性反應(yīng)，具有操作簡單、特異性強、靈敏度高的特點，并且可快速的檢測多種樣品。因此，本實驗通過制備抗NOR單克隆抗體的免疫學(xué)分析方法，檢測樣品中的NOR的含量，具有重要的意義。通過抗原合成和動物免疫，細胞融合和篩選實驗制備雜交瘤細胞株，并根據(jù)競爭抑制ELISA原理，以分泌的單克隆抗體建立了檢測諾氟沙星殘留的競爭抑制ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、奧比沙星、氧氟沙星、達氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星購于上海安譜實驗科技股份有限公司。牛血清白蛋白（BSA）購于生工生物有限公司，雞血清白蛋白（OVA）購于Sigma公司，諾氟沙星（NOR）標(biāo)準(zhǔn)品購于上海安譜實驗科技股份公司。N，N-二甲基甲酰胺（DMF），乙基碳二亞胺（EDC），N羥基琥珀酰亞胺（NHS）。RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、HAT（50×）、HT（100×）以及抗生素（青霉素，鏈霉素）均購自Gibco公司，弗氏完全（不完全）佐劑購自Sigma公司，PAA優(yōu)等級胎牛血清，羊抗鼠 IgGHRP 結(jié)合物（二抗）購自北京中杉公司。

1.1.2 主要儀器

生物安全柜，HH6數(shù)顯恒水浴鍋，酶標(biāo)儀，恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱，TDL5低速臺式離心機，紫外分光光度計，倒置顯微鏡

1.1.3 實驗動物及骨髓瘤細胞

BALB/c雌性小鼠（8周齡）購于上海斯萊克動物中心。小鼠骨髓瘤細胞SP2/0來自廈門大學(xué)。

1.2 人工抗原制備與鑒定

方法參考文獻[18]，諾氟沙星分子中帶有羧基，采用優(yōu)化的碳二亞胺法制備人工抗原，利用EDC，將諾氟沙星與牛血清白蛋白BSA或雞血清白蛋白OVA中的氨基偶聯(lián)起來，制備人工抗原NORBSA和NOROVA。采用文獻[19]中的方法，用1×TAE工作液配制凝膠糖凝膠。交聯(lián)產(chǎn)物NORBSA和BSA載體蛋白各15 μL，與上樣緩沖液等體積混勻上樣。設(shè)置時間30 min，電壓50 V跑膠。取出瓊脂糖凝膠塊，用考馬斯亮藍R250染色液染色5h?；厥湛捡R斯亮藍R250染色液，并加入脫色液脫色，直到條帶清晰為止。人工抗原通過紫外光譜掃描和紅外光譜掃描鑒定。

1.3 小鼠免疫

取雌性BALB/c小鼠（8周齡）3只，首免將100ug免疫抗原NORBSA和弗式完全佐劑溶液等體積混合，用注射器進行乳化。乳化完全后，皮下多點進行注射免疫雌性BALB/c小鼠，每只200ul。每隔兩周對小鼠再次免疫，用50ug免疫原和弗式不完全佐劑溶液混合。免疫4次后，進行尾部取血測效價，血清收集于250ul的離心管中，37℃水浴鍋中孵育30min，按照間接ELISA的方法來測定小鼠的效價。血清的效價達到1：8000以上，腹腔注射100ugNORBSA加強免疫BALB/c小鼠，200ul/每只。3天后無菌取脾細胞進行細胞融合。

1.4 細胞融合與雜交瘤細胞的篩選

取一只效價在1：8000以上的并且加強免疫的BALB/c小鼠，摘眼球放血，無菌研磨脾臟制備脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞用37℃預(yù)熱的PEG1450進行融合，速度由慢到快，邊滴加邊搖晃離心管，使細胞充分融合，并在其中加入飼養(yǎng)細胞?；旌霞毎麘乙杭尤?6孔板中，每孔200 μL。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在5～7天時，出現(xiàn)肉眼可見的克隆或在倒置顯微鏡下可觀察到雜交瘤細胞布滿孔底的1/5面積時就可檢測抗體。標(biāo)出只有單個克隆長出的孔，取上清用非競爭ELISA方法檢測雜交瘤細胞的效價。挑選細胞集落較少，狀態(tài)良好，細胞上清檢測效價比較高的細胞培養(yǎng)孔，采用有限稀釋法，進行亞克隆篩選。將檢測為陽性孔的雜交瘤細胞進行擴大培養(yǎng)，分別用48孔板，24孔板，12孔板，6孔板培養(yǎng)。大約經(jīng)過3～4次的亞克隆，就可以篩選到效價穩(wěn)定的單克隆細胞株，將其凍存在液氮中。

1.5 腹水制備和抗體純化

選擇兩只8周齡Balb/c雌性小鼠，體內(nèi)注射0.5ml的液體石蠟油致敏，一周后將處于對數(shù)生長期的7C4雜交瘤細胞，約1×106個/mL細胞接種于致敏后的小鼠腹腔內(nèi)。待第7天左右開始密切觀察小鼠的腹水及存活情況，如果活力佳，有明顯移動性腹水，可以放腹水2次左右；若發(fā)現(xiàn)小鼠活動受限，要立即處死放腹水。收集腹水用辛酸硫酸銨沉淀法純化，SDSPAGE 凝膠電泳分析純化結(jié)果。

1.6 抗諾氟沙星單克隆抗體特性的鑒定

1.6.1 單克隆抗體細胞亞類鑒定

利用抗體亞類鑒定試劑盒對抗諾氟沙星單克隆抗體進行亞型的鑒定，將試劑盒放在室溫30 min，取出試劑盒中IgM，IgG2a，IgG2b，IgG1，IgG3，IgA6個試劑，并將它們各自按1：1000倍進行稀釋，各孔加入上述的各類試劑（100 μL /孔）。37℃，1 h。洗板后，加入5%的PBSM封閉液200 uL，37℃封閉2 h。其余操作步驟同間接ELISA。

1.6.2 單克隆抗體效價的測定

間接ELISA法測定單抗體的細胞上清液效價。以NOROVA的最佳抗原稀釋度包被，對待測的單克隆抗體細胞培養(yǎng)上清液進行倍比稀釋，每孔100 μL加入酶標(biāo)板中。陽性對照以空白小鼠的血清作對比，陰性對照以骨髓瘤細胞的上清液為對照。

1.6.3 單克隆抗體與載體蛋白的交叉反應(yīng)性

用包被緩沖液將載體蛋白BSA、OVA和抗原NORBSA、NOROVA各自稀釋到相同濃度進行包被。一抗加入稀釋好的單克隆抗體，酶標(biāo)儀測定450nm下的OD值。

1.6.4 單克隆抗體親和力的測定

單克隆抗體親和力常數(shù)Kaff，依據(jù)Batty飽和法測定[20]。按照iELISA測效價方法包被抗原NORBSA，包被濃度依次為0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL，包被過夜。一抗為倍比稀釋的純化抗體。親和力的計算公式為：

1.7 標(biāo)準(zhǔn)競爭曲線的繪制

用方陣滴定法測定包被抗原（NOROVA） 和單克隆抗體的最佳工作濃度，選擇是OD值為1.0左右的單抗?jié)舛茸鳛樽罴压ぷ鳚舛?。通過加入不同濃度的NOR標(biāo)準(zhǔn)品，競爭一定濃度的抗原，建立 NOR 競爭標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算IC50。具體方法為：競爭NOR濃度分別為 0、1.9531、3.9023、7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000 ng/ mL，橫坐標(biāo)代表NOR標(biāo)準(zhǔn)品競爭濃度的對數(shù)值，縱坐標(biāo)代表諾氟沙星的抑制率（B/B0），繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。根據(jù) B/B0值和曲線方程計算NOR的濃度，算出的最低的NOR濃度就是最低檢出限。抑制率達到90%時所對應(yīng)的NOR的濃度就是最低檢出限。抑制率為20%80%之間所對應(yīng)的NOR濃度就是檢測的線性范圍。

1.8 NOR單抗與結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)性

用包被緩沖液以最佳抗原稀釋度包被抗原NOROVA，分別設(shè)置不同濃度的諾氟沙星，氧氟沙星，奧比沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，沙拉沙星，二氟沙星，氧氟沙星共八種喹諾酮類藥物作為競爭抗原，用間接競爭ELISA測不同藥物對抗NOR單克隆抗體的抑制率。根據(jù)公式計算諾氟沙星與其它幾種FQs結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率：

交叉反應(yīng)率（CR%）= IC50諾氟沙星/IC50反應(yīng)物×100%

2 結(jié)果

2.1 完全抗原偶聯(lián)物的鑒定

完全抗原在瓊脂糖凝膠中電泳的結(jié)果如圖1所示。當(dāng)NOR與載體蛋白BSA交聯(lián)后，其遷移速度比載體蛋白BSA快，表明BSANOR的分子量大于BSA，證明偶聯(lián)成功。從電泳結(jié)果看，偶聯(lián)產(chǎn)物的電泳遷移與載體蛋白存在明顯的差異，且偶聯(lián)產(chǎn)物的遷移速度比載體蛋白快。

2.2 小鼠免疫

小鼠經(jīng)過5次免疫，采血后分析每只小鼠的血清效價。加強免疫后3只小鼠的血清效價都達到 1：64000 以上，其中1號和2號小鼠的效價在1：8000時可達到1.0 以上，3號小鼠的效價較低。因此選擇的小鼠1進行細胞融合。經(jīng)間接ELISA實驗，結(jié)果證明人工抗原刺激小鼠產(chǎn)生的抗血清對諾氟沙星的具有良好的特異性反應(yīng)。

2.3 雜交瘤細胞株的篩選

細胞融合一周后觀察效果，用間接競爭ELISA 檢測細胞上清，測得融合率陽性率高達90%。挑選細胞集落較少，狀態(tài)良好，細胞上清檢測效價OD值比較高的10孔細胞培養(yǎng)孔進行克隆，經(jīng)過有限稀釋法四次亞克隆后，篩選出3 株分泌穩(wěn)定抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為7C4、11G7和8G3。

2.4 單克隆抗體性質(zhì)的研究

2.4.1 單克隆抗體亞型鑒定

利用抗體亞類試劑盒，對3個單抗細胞株的亞類進行鑒定，由實驗結(jié)果得知：7C4、11G7、8G3細胞株的亞型，分別為：Ig2b，Ig2b，IgG1型。

2.4.2 單克隆抗體細胞效價的測定

利用間接ELISA的方法檢測不同雜交瘤細胞細胞株分泌的單克隆的效價。由實驗結(jié)果得知：細胞株7C4、11G7和8G3的效價分別為1：512，1：1024，1：1024。純化之后的抗體效價達到1：128000，1：128000，1：128000。

2.4.3 單克隆抗體與載體蛋白的交叉反應(yīng)性

實驗結(jié)果得知：用載體蛋白BSA以及OVA包被酶標(biāo)孔，ELISA檢測雜交瘤細胞上清效價接近于0，而用NORBSA、NOROVA包被酶標(biāo)孔，ELISA檢測2株單抗細胞株都顯示出一定的效價。由此得知：篩選得到的單抗細胞株與載體蛋白無交叉反應(yīng)，具有很高的特異性。

2.4.4 SDSPAGE鑒定純化后的抗體

腹水經(jīng)辛酸硫酸銨純化后，用SDSPAGE檢測顯示純化后的單抗有兩條條帶，一條條帶的分子量約在25 kD為輕鏈，一條是分子量約為50 kD的重鏈，達到純化要求。腹水純化后的蛋白質(zhì)經(jīng)BCA法測得含量為10.1mg/mL。

2.5 檢測NOR的間接競爭ELISA 方法的建立

2.5.1 包被抗原與單克隆抗體最佳工作濃度的測定

依據(jù)抗原抗體用量最省的原則，選擇OD值為1.0左右的值為抗原和抗體的最大稀釋倍數(shù)。通過方陣滴定法，確定包被抗原NORBSA最佳工作濃度為0.22ug/ml，單克隆抗體的組價稀釋倍數(shù)為1：64000。

2.5.2 單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)競爭曲線的繪制

雜交瘤細胞株7C4的單抗競爭抑制曲線如圖5。從Origin8.0軟件分析的數(shù)據(jù)可以看到，NOR的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上，曲線方程為y=0.29358x+1.0293，R2=0.99136，IC50值為31225ng，其檢測線性范圍為 5.011ng～630.95ng，最低檢測線為2.75ng。 通過非競爭ELISA法測定細胞株的親和力常數(shù)。測得雜交瘤細胞株7C4的親和力KAff常數(shù)為4.6×108。

2.5.3 單克隆抗體特異性測定

將抗NOR抗體與幾種其他藥物進行交叉反應(yīng)性檢測，由下表結(jié)果表示，抗NOR 抗體與諾氟沙星（100%）、環(huán)丙沙星（42.82%）、恩諾沙星（17.74%）、奧比沙星（15.30%）、氧氟沙星（11.61%）、達氟沙星（17.35%）、沙拉沙星（4.378%）、二氟沙星（0.963%）幾種抗菌藥均有交叉反應(yīng)率，這說明該免疫學(xué)方法可同時檢測8種FQs獸藥殘留。

3 討論

本實驗通過抗原合成和動物免疫，細胞融合和篩選實驗，獲得了3株雜交瘤細胞株，并根據(jù)競爭抑制ELISA原理，以7C4分泌的單克隆抗體建立了檢測諾氟沙星殘留的競爭抑制ELISA方法。制備的單抗對喹諾酮類藥物中的其他藥物具有良好的識別性能，能夠滿足中國與歐盟等地區(qū)對氟喹諾酮類藥物殘留的檢測要求。國內(nèi)外已有制備喹諾酮類相關(guān)文獻的報道，如劉慶堂等[21]通過碳二亞胺法制備的諾氟沙星單克隆抗體細胞株，其IC50為2.52 μg/L，而本文所得的單克隆抗體的IC50為31.225 ng/mL，最低檢測限2.75 ng/mL，相對較高。本文篩選得到的諾氟沙星單克隆抗體可以與七種喹諾酮類藥物，環(huán)丙沙星、恩諾沙星、奧比沙星、氧氟沙星、達氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星交叉反應(yīng)率較高。對諾氟沙星的分子結(jié)構(gòu)分析，諾氟沙星（NOR）具備第三代喹諾酮類結(jié)構(gòu)的共同特征：在萘啶環(huán)的6位C原子和7位C原子上分別引入一個氟原子和哌嗪環(huán)，這些基團的引入沙星類抗菌素的抗菌活性不斷增強[22，23]，并且抗菌譜也拓寬了。因此在保留NOR特征結(jié)構(gòu)的原則下，選擇諾氟沙星3位碳原子上的羧基與載體蛋白偶聯(lián)，保留了抗菌活性。但是也由于諾氟沙星具有共同結(jié)構(gòu)，所以由細胞融合實驗制得的單克隆抗體與其他各類喹諾酮類藥物有很大的交叉反應(yīng)性，因此可同時檢測其他八種獸藥殘留。Jiang等[8]制備的諾氟沙星抗體除了對培氟沙星（33.6%）和洛美沙星（21.8%）有略高的交叉反應(yīng)率，除此之外對其他的類似物反應(yīng)率較低。劉慶堂[24]等研究的NOR MAb 對二氟沙星和沙拉沙星有較小的交叉反應(yīng)性，李超英[21]等研制的NOR抗體與環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星、恩諾沙星和洛美沙星具有較高的交叉反應(yīng)率。在另一篇報道中，NOR半抗原在哌嗪環(huán)上含有一個氨基，通過引入氨基和載體偶聯(lián)在一起。因此產(chǎn)生的抗體可以識別13種喹諾酮藥物[25]。在這種情況下，喹諾酮的共同的結(jié)構(gòu)被導(dǎo)入到免疫系統(tǒng)，因此得到的抗體表現(xiàn)出廣泛的特異性。

4 結(jié)論

本研究以細胞融合技術(shù)制備得到抗NOR的單克隆抗體，最后篩選出三株命名為7C4，11G7，8G3的雜交瘤細胞株，亞型鑒定分別為IgG2b，IgG2b，IgG1。在方陣滴定法的基礎(chǔ)上，建立了間接競爭ELISA方法。建立的icELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性檢測范圍為5.011～630.95ng，最低檢測限和IC50值分別為2.75ng和31.225ng。單抗與其它八種結(jié)構(gòu)類似物有交叉反應(yīng)性。

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基金項目：廈門市海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目（14CZP047HJ21）、（13PZP002SF24），教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金（201507030002），福建省教育廳中青年教師教育科研項目（JA15276）

作者簡介：徐田麗（1992-），女，碩士研究生，研究方向：微生物。

通訊作者：蘇國成（1962-），男，教授，研究方向：應(yīng)用微生物、食品安全、食品生物技術(shù)。