響應(yīng)面法優(yōu)化谷氨酸亞鐵的制備工藝

黃 杰,于 新,刁麗婷,黃曉敏

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東 廣州 510225)

響應(yīng)面法優(yōu)化谷氨酸亞鐵的制備工藝

黃 杰,于 新*,刁麗婷,黃曉敏

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東 廣州 510225)

以氯化亞鐵和谷氨酸鈉為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化谷氨酸亞鐵的固液相法制備工藝條件，選定介質(zhì)pH值、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，通過(guò)中心組合試驗(yàn)，建立二次回歸方程。結(jié)果表明，反應(yīng)物物質(zhì)的量比、介質(zhì)pH值、反應(yīng)時(shí)間及溫度對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率均有一定的影響。優(yōu)化的制備工藝條件為谷氨酸與Fe2+物質(zhì)的量比1∶1、介質(zhì)pH 5.76、反應(yīng)時(shí)間0.75 h、反應(yīng)溫度58.9 ℃，產(chǎn)率為77.79%。反應(yīng)產(chǎn)物谷氨酸亞鐵螯合物的組成為Fe(C5H7NO4)·2H2O。

谷氨酸亞鐵；響應(yīng)面分析；食品添加劑；制備工藝；優(yōu)化

鐵是人體必需的微量元素之一[1]，是血紅素、肌蛋白和細(xì)胞色素的重要組成部分和氧化還原酶的激活劑，鐵在人體中分布很廣。膳食中若長(zhǎng)期缺鐵或鐵吸收障礙，可引起缺鐵性貧血，影響紅細(xì)胞的代謝，降低人體免疫功能，并對(duì)青少年兒童的生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重影響，鐵代謝的重要性已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)紅細(xì)胞和血紅蛋白的范圍[2-3]。

食品與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)的研究表明，微量元素添加劑——氨基酸螯合物具有化學(xué)性能穩(wěn)定、生物效價(jià)高、無(wú)毒無(wú)刺激性、適口性好、補(bǔ)充人體必須微量元素、增強(qiáng)人體免疫功能、提高人體抗應(yīng)激能力等特性[4]。因此，氨基酸螯合物成為目前國(guó)際公認(rèn)的最佳微量元素營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑或添加劑。隨著乳鐵蛋白抑菌功能的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用技術(shù)的研究，人們利用動(dòng)植物蛋白資源開(kāi)發(fā)復(fù)合蛋白氨基酸亞鐵，但是純化的蛋白質(zhì)使用成本高，且蛋白質(zhì)與亞鐵的螯合率不高，產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)方法與檢驗(yàn)指標(biāo)尚未完善。甘氨酸作為結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的氨基酸，其與Fe2+的反應(yīng)得到了廣泛研究[5]。張大飛等[6]以甘氨酸和硫酸亞鐵銨為原料，采用熔融法合成甘氨酸亞鐵絡(luò)合物，確定其化學(xué)式為(NH2CH2COO)2Fe·2H2O；李大光等[7]以氯化亞鐵和甘氨酸為原料，利用一步室溫固相反應(yīng)合成了一水合甘氨酸亞鐵；俞露等[8]以甘氨酸與碳酸亞鐵為原料，固液相法合成了陰離子干擾少、純度較高的甘氨酸亞鐵螯合物，判斷甘氨酸亞鐵是帶10個(gè)結(jié)晶水的反式結(jié)構(gòu)螯合物。作為體內(nèi)代謝的基本氨基酸之一的酸性氨基酸——谷氨酸[9-11]，其與亞鐵鹽的螯合物研究未見(jiàn)報(bào)道。

味精即谷氨酸鈉作為調(diào)味品或食品添加劑在中國(guó)、美國(guó)、英國(guó)、日本等國(guó)家已經(jīng)食用100多年，能夠顯著增加食品的鮮味，并且是安全的。但是，在使用味精調(diào)味的同時(shí)，增加了Na+食用量，容易出現(xiàn)口渴、嗜睡的生理現(xiàn)象[12]。L-谷氨酸屬“非必需”，在人體內(nèi)可由α-酮戊二酸產(chǎn)生。L-谷氨酸是一種氨基酸類藥物，用于肝昏迷、癲痢預(yù)防、減輕酮尿癥和酮血癥等，亦是一種腦營(yíng)養(yǎng)劑，也可作肝臟藥物谷胱甘肽的生產(chǎn)原料[13]。以其制備谷氨 酸亞鐵，兼具調(diào)味、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和預(yù)防缺鐵性貧血癥的作用。

本實(shí)驗(yàn)以氯化亞鐵和谷氨酸鈉為主要原料，通過(guò)控制反應(yīng)條件和降低產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的溶解度，探尋制備谷氨酸亞鐵的工藝。根據(jù)多元回歸分析多個(gè)獨(dú)立變量及其交互關(guān)系對(duì)依變量的影響[14]，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化谷氨酸亞鐵的制備工藝，旨在對(duì)谷氨酸亞鐵的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碳酸鈉、氯化亞鐵、鐵粉、氫氧化鈉（均為分析純） 天津市福晨化學(xué)試劑廠；乙醇（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；鹽酸（分析純） 廣州化學(xué)試劑二廠；谷氨酸鈉 河南蓮花味精股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外光譜儀 日本島津公司；PerkinElmer Spectrum 100（84544）傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)珀金埃爾默公司；HCT-1型微機(jī)差熱天平 北京恒久科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 谷氨酸亞鐵的制備

將一定量的碳酸鈉和氯化亞鐵分別溶于適量去離子水，攪拌，將碳酸鈉溶液緩慢加入氯化亞鐵溶液中，充分反應(yīng)。靜置，過(guò)濾，用蒸餾水洗滌沉淀物，直至無(wú)氯離子檢出為止。

將一定量的谷氨酸鈉溶于適量去離子水，用0.05 mol/L鹽酸調(diào)至pH 3.22，使其發(fā)生沉淀，靜置過(guò)濾，得谷氨酸。將新制得的碳酸亞鐵傾入谷氨酸的熱水溶液中，同時(shí)加入鐵粉，調(diào)至pH 4.0～5.0。加熱攪拌，80 ℃恒溫反應(yīng)60 min。過(guò)濾，濾液濃縮，加入適量無(wú)水乙醇使沉淀析出[15]。抽濾，洗滌，真空干燥，稱量，得產(chǎn)物谷氨酸亞鐵。

其反應(yīng)式為:

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 介質(zhì)pH值對(duì)產(chǎn)率的影響

選取pH值范圍4～7、投料物質(zhì)的量比1∶1、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間1.0 h。以反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察介質(zhì)pH值對(duì)谷氨酸亞鐵制備的影響。

1.3.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)率的影響

選取反應(yīng)溫度范圍30～90 ℃、介質(zhì)pH 6、投料物質(zhì)的量比1∶1、反應(yīng)時(shí)間1.0 h。以反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察反應(yīng)溫度對(duì)谷氨酸亞鐵制備的影響。

1.3.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響

選取反應(yīng)時(shí)間范圍0.5～3 h、介質(zhì)pH 6、投料物質(zhì)的量比1∶1、反應(yīng)溫度60 ℃。以反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)谷氨酸亞鐵制備的影響。

1.3.2.4 投料物質(zhì)的量比對(duì)產(chǎn)率的影響

選取谷氨酸與Fe2+物質(zhì)的量比范圍1∶1～3∶1、介質(zhì)pH 6、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間1.0 h。以反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察投料物質(zhì)的量比對(duì)谷氨酸亞鐵制備的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定因素水平，采用Design-Expert 8.05b軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，以反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率為響應(yīng)值，優(yōu)化谷氨酸亞鐵的制備工藝條件。

1.3.4 產(chǎn)物的鑒定方法

真空干燥產(chǎn)物，定量測(cè)定產(chǎn)物結(jié)晶水?dāng)?shù)目；紫外-可見(jiàn)分光光度法、紅外光譜法配合確定螯合物是否生成[16-18]；示差掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）法分析測(cè)定螯合物結(jié)晶水分解溫度、螯合物的熔點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 介質(zhì)pH值對(duì)谷氨酸亞鐵產(chǎn)率的影響

谷氨酸和Fe2+的配位反應(yīng)與介質(zhì)pH值有密切關(guān)系。谷氨酸的等電點(diǎn)3.22，在pH值小于4的酸性條件下，H+與Fe2+爭(zhēng)奪供電子基團(tuán)，H+易與谷氨酸根離子結(jié)合生成谷氨酸，從而不利于谷氨酸亞鐵螯合物的形成；在pH值大于7的堿性條件下，F(xiàn)e2+易氧化水解，生成Fe(OH)3沉淀。因此，本試驗(yàn)選取pH 4～7范圍進(jìn)行考察。由圖1可見(jiàn)，在pH 4～7范圍內(nèi)均可生成谷氨酸亞鐵，pH值對(duì)產(chǎn)物的配位比影響不大，但對(duì)產(chǎn)率有較大的影響。pH值不大于6時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率隨著介質(zhì)pH值的升高而增大；pH值不小于6時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率逐漸減小。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇pH 6.0設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)谷氨酸亞鐵產(chǎn)率的影響

反應(yīng)溫度對(duì)谷氨酸和Fe2+的配位反應(yīng)有影響。升高溫度可以加快反應(yīng)速率，但促進(jìn)Fe2+水解，生成Fe(OH)3沉淀，且影響產(chǎn)物的穩(wěn)定性。在30～60 ℃范圍內(nèi)，隨反應(yīng)溫度升高，產(chǎn)物產(chǎn)率增加；溫度大于60 ℃，產(chǎn)物產(chǎn)率明顯降低（圖2）。螯合反應(yīng)是一個(gè)放熱反應(yīng)[19]，升溫雖然可加快反應(yīng)速率，但抑制正反應(yīng)的進(jìn)行。選擇溫度60 ℃設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)谷氨酸亞鐵產(chǎn)率的影響

碳酸鈉和氯化亞鐵的反應(yīng)為復(fù)分解反應(yīng)，反應(yīng)速率快，因此在制備碳酸亞鐵過(guò)程中，緩慢攪拌加入碳酸鈉溶液，反應(yīng)15～30 min即可。如圖3所示,碳酸亞鐵與谷氨酸的反應(yīng)時(shí)間達(dá)到1 h時(shí)產(chǎn)率較高。此后，由于Fe2+在空氣中易被氧化，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)物產(chǎn)率降低。因此選用反應(yīng)時(shí)間1.0 h設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 投料物質(zhì)的量比對(duì)谷氨酸亞鐵制備的影響

配位比即配體與金屬離子的物質(zhì)的量之比[20]，它是影響金屬離子與氨基酸配位反應(yīng)的一個(gè)重要因素，配位比對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)率、產(chǎn)物中Fe2+的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）有較大影響。碳酸鈉與氯化亞鐵按1∶1的物質(zhì)的量比投料進(jìn)行反應(yīng)，防止任何一種物質(zhì)過(guò)量而影響碳酸亞鐵的純度。

由圖4可知，在物質(zhì)的量比為1∶1～2∶1時(shí)，隨谷氨酸量的增加，產(chǎn)物產(chǎn)率隨之增加，F(xiàn)e2+含量有增加的趨勢(shì)，但不明顯。谷氨酸和Fe2+物質(zhì)的量比為2∶1時(shí)，產(chǎn)物中Fe2+含量達(dá)到最高。當(dāng)物質(zhì)的量比大于2∶1，F(xiàn)e2+含量有所降低，而產(chǎn)率繼續(xù)增加，但增幅減小。這是因?yàn)樵黾庸劝彼嵛镔|(zhì)的量，促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行，使產(chǎn)率增大，但同時(shí)也會(huì)增加產(chǎn)物中游離谷氨酸的含量，使亞鐵的含量降低。綜合考慮，選取1∶1作為谷氨酸與Fe2+制備谷氨酸亞鐵配合物的最佳物質(zhì)的量比，用在響應(yīng)面試驗(yàn)中。

2.2 產(chǎn)物鑒定

2.2.1 產(chǎn)物的物理性質(zhì)

墨綠色粉末，不透明，鮮味突出，溶于水。取2 g樣品，160 ℃真空干燥至質(zhì)量恒定，失質(zhì)量0.30 g，占15%，與失去兩分子結(jié)晶水的理論值相當(dāng)，即該化合物帶兩個(gè)結(jié)晶水，符合化學(xué)式Fe(C5H7NO4)·2H2O。

2.2.2 紫外光譜分析

分別配制1.0%的谷氨酸、谷氨酸亞鐵溶液，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍測(cè)其吸收光譜。

由圖5可知，谷氨酸遠(yuǎn)紫外區(qū)最大吸收峰位于205 nm波長(zhǎng)處，谷氨酸亞鐵位于214 nm波長(zhǎng)處，向長(zhǎng)波方向移動(dòng)9 nm。相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，谷氨酸亞鐵最大吸收峰高度比谷氨酸有明顯的增高，且在303 nm波長(zhǎng)附近有一寬肩峰。符合金屬氨基酸螯合物的生成會(huì)使其近紫外吸收峰發(fā)生紅移一般規(guī)律。由此可證明谷氨酸亞鐵螯合物的生成。這與已有研究[21-22]中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、賴氨酸的銅、鋅螯合物的紫外吸收峰紅移具有類似結(jié)果。

2.2.3 紅外光譜分析

K B r壓片法測(cè)定谷氨酸和谷氨酸亞鐵在400～4 000 cm-1的紅外光譜。

從圖6可知，谷氨酸與Fe2+形成螯合物后，其主要吸收峰數(shù)量、峰形、波數(shù)、強(qiáng)度與配體相比發(fā)生了明顯變化。谷氨酸在3 650～3 200 cm-1間出現(xiàn)游離O—H基的伸縮振動(dòng)吸收，羥基濃度高，形成氫鍵的能力更強(qiáng)，發(fā)生締合現(xiàn)象，O—H基伸縮振動(dòng)吸收峰向低波數(shù)方向位移，在3 100～2 900 cm-1出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)吸收峰，峰形尖銳，而谷氨酸亞鐵則是在3 100～3 500 cm-1間有一較寬的強(qiáng)吸收峰，較谷氨酸配體向高波數(shù)移動(dòng)，表明谷氨酸亞鐵中游離O—H基濃度低，不存在分子間的締合作用，O—H基與Fe2+發(fā)生了反應(yīng)。谷氨酸在3 069 cm-1處的N—H鍵伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，在形成配合物后發(fā)生了位移，且在1 500 cm-1附近無(wú)NH3+的彎曲振動(dòng)峰。在540 cm-1處出現(xiàn)了Fe—N的伸縮振動(dòng)峰[23]，說(shuō)明α-氨基N原子參與了配位。在1 619 cm-1和1 406 cm-1出現(xiàn)的吸收峰分別是COO-的反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，較配體向高波數(shù)移動(dòng)（谷氨酸的COO-的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)為1 517 cm-1和1 311 cm-1），表明C1羧基是以單齒方式配位。配合物中仍有羧基的特征峰（3 375 cm-1左右），表明谷氨酸中C5羧基未參與配位[24-25]。

2.2.4 DSC分析

取5 mg樣品，在HCT-1型微機(jī)差熱天平上以α-Al2O3為參比在氮?dú)鈿夥罩羞M(jìn)行測(cè)試，升溫速率20 ℃/min，溫度范圍20～200 ℃。從圖7可看到，DSC曲線在132 ℃有一吸熱峰，說(shuō)明螯合物結(jié)晶水受熱分解，DSC曲線在171.9 ℃有一吸熱峰，螯合物在此溫度左右開(kāi)始熔化，慢慢發(fā)生分解。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素水平取值。采用Design-Expert 8.05b軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案（表1），根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得到數(shù)學(xué)模型為:

Y=-136.3+42.58A+3.042B+4.307C-0.192 0AB+ 0.220 0AC-0.056 00BC-2.726A2-0.016 06B2-1.526C2

根據(jù)表2方差分析，數(shù)學(xué)模型P=0.001 3＜0.05，說(shuō)明該模型顯著；失擬項(xiàng)P=0.944 1＞0.05不顯著，R2=0.944 2，變異系數(shù)0.41%，說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型對(duì)試驗(yàn)擬合較好，試驗(yàn)誤差小，可以用來(lái)預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。3 個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均有一定的影響，各個(gè)因素對(duì)谷氨酸亞鐵的制備工藝條件影響的次序由大到小依次為:A＞B＞C，即介質(zhì)pH值＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間；因素間的交互作用AB對(duì)試驗(yàn)結(jié)果也有一定的影響[26-27]。

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型，得到響應(yīng)值最大時(shí)的優(yōu)化條件:介質(zhì)pH 5.76、反應(yīng)溫度58.9 ℃、反應(yīng)時(shí)間0.75 h。按照此條件重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)率分別為78.1%、77.61%、77.68%，回歸方程所得的預(yù)測(cè)值77.64%與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均值77.79%相差不大，因此，谷氨酸亞鐵的最佳制備工藝條件為:介質(zhì)pH 5.76、反應(yīng)溫度58.9 ℃、反應(yīng)時(shí)間0.75 h、投料物質(zhì)的量比1∶1。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以氯化亞鐵和谷氨酸鈉為主要原料，通過(guò)固液相反應(yīng)法制得陰離子干擾少、穩(wěn)定性好的谷氨酸亞鐵。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化獲得的較佳制備工藝條件為投料物質(zhì)的量比1∶1、介質(zhì)pH 5.76、反應(yīng)溫度58.9 ℃、反應(yīng)時(shí)間0.75 h，產(chǎn)率為77.79%，其組成為Fe(C5H7NO4)·2H2O。該制備反應(yīng)工藝簡(jiǎn)單，原料成本較低，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

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Optimization of the Preparation Process of Ferrous Glutamate by Response Surface Methodology

HUANG Jie, YU Xin*, DIAO Liting, HUANG Xiaomin
(College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)

Ferrous glutamate was prepared from ferrous chloride and sodium glutamate by a solid-liquid phase method. The preparation process was optimized using combination of single factor method and response surface methodology. A quadratic regression model indicating the effect of three variables including medium pH, reaction temperature and time on ferrous glutamate yield was established using a central composite design. The results showed that the optimal conditions for preparing ferrous glutamate were determined as follows: molar ratio of C5H9NO4to Fe2+, 1:1; medium pH, 5.76; reaction temperature, 58.9 ℃; and reaction time, 0.75 h. Under these conditions, the yield of ferrous glutamate was 77.79%. The chemical formula of the ferrous glutamate was Fe(C5H7NO4)·2H2O.

ferrous glutamate; response surface methodology; food additive; preparation process; optimization

O614.81

A

10.7506/spkx1002-6630-201510016

2014-09-29

黃杰(1989—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：lawrence0817@163.com

*通信作者：于新(1959—),男,教授,碩士,研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：yuxin1959@aliyun.com