海洋微生物固氮作用研究進展

周海霞，劉其友，鄭經(jīng)堂

（中國石油大學（華東）化學工程學院，山東 青島266580）

氮元素是海洋初級生產(chǎn)力的主要限制因素。海洋中氮元素的補充有三條途徑：（1）陸源輸入，氮營養(yǎng)鹽從土壤中被溶淋出，經(jīng)由河流、湖泊進入海洋生態(tài)系統(tǒng)。這一過程主要影響河口地區(qū)和近海，增加水體等的富營養(yǎng)化；（2）空氣中的氮經(jīng)過閃電和宇宙射線輻射轉(zhuǎn)化為少量可溶性氨；（3）海洋微生物的固氮作用，即海洋微生物在固氮酶作用下將N2催化還原為。具有固氮作用的微生物不僅能夠通過固定N2來支持自身生長，還能通過細胞分泌等過程向環(huán)境釋放結(jié)合態(tài)氮，從而緩解周圍的氮限制[1］。在海洋環(huán)境中，微生物固氮作用經(jīng)過長期進化給海洋環(huán)境提供了新的氮源，對于增加寡營養(yǎng)海域的新生產(chǎn)力具有重要生物學意義。

1 海洋固氮微生物的種類

隨著人們對固氮微生物研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)了越來越多的新的種類。從最初的只能檢測到個別微生物具備固氮能力，發(fā)展到利用乙炔還原法和同位素標記[2］檢測許多微生物能夠進行固氮，直至利用聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測固氮酶基因nifH或nifHmRNA，極大地拓展了人們對固氮微生物多樣性和固氮活性的認識。目前已知的固氮微生物均屬于古菌域和細菌域[3］，還沒有發(fā)現(xiàn)能進行固氮的真核微生物。根據(jù)微生物的生理特點和生物種類，可將固氮微生物分為不同的生理類群和生物類群。

1.1 固氮微生物的生理類群

按照固氮菌和其它生物的生理關(guān)系，可將固氮微生物分為三種主要生理類型[4，5］：自生固氮菌、聯(lián)合固氮菌和共生固氮菌。固氮是厭氧過程，但某些微生物在固氮的同時仍然產(chǎn)生氧氣，按照微生物在固氮時是否有氧氣產(chǎn)生，還可將自生固氮菌分為好氧性自生固氮菌和厭氧性自生固氮菌。

自生固氮菌是能夠獨立生活并固氮的微生物。1961年，Dugdale等[6］進行海洋Trichodesmium 固氮研究，通過示蹤證實了它具有固氮能力。后續(xù)研究表明Trichodesmium是海洋中重要的固氮微生物之一。

聯(lián)合固氮菌是能夠獨立生活的固氮微生物，通過定植于植物根系表面或附近土壤或侵入植物根部，依靠植物根系分泌物生長，同時提供固定的氮滿足植物生長需要，二者形成松散的共生關(guān)系。海草Zostera marina根系周圍的沉積物能夠刺激微生物固氮活性，再通過氮轉(zhuǎn)移獲得海草生長需要的氮源。固氮微生物和海草的生長之間是相互促進的關(guān)系，研究表明多糖和藻酸鹽等能夠使沉積物固氮速率提高幾倍到上百倍[7，8］。

共生固氮菌是必須和另一種生物密切生活在一起才能進行固氮的微生物，二者生存關(guān)系密切，單獨生活時不能進行固氮。固氮菌通過固定氮獲得氨基酸和蛋白質(zhì)，然后提供給共生生物，同時從共生生物那里獲得必需的碳源和能源[9］。能與固氮微生物共生的海洋生物有珊瑚、海綿、船蛆、硅藻等[10］。

1.2 固氮微生物的生物類群

Zehr等[3］在2003年將含有nifH 固氮基因的微生物進行分類整理，得到10個門或者綱（Group），共67個屬，廣泛分布在原核微生物中。這說明固氮能力對微生物來說十分重要。Dos Santos等[11］用6種固氮酶基因編碼的產(chǎn)物NifHDK和NifENB搜索所有的微生物基因組序列，結(jié)果獲得13個細菌門和1個古菌門，共109個屬，149個種，其中82個種是已知的固氮微生物，67個種固氮能力未知。作者從GenBank中搜索含有nifH基因的微生物，共得到116個屬，比Zehr等[3］在2003年統(tǒng)計的固氮微生物種屬增加了近1倍，這說明10年間人們對固氮微生物的研究取得了前所未有的進步。

2 固氮基因的多樣性

PCR技術(shù)推動了微生物生態(tài)研究走向分子階段。該技術(shù)不依賴于活的微生物，更不需要檢驗微生物的功能活性。采用PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了大量未知的不可培養(yǎng)微生物。對極端環(huán)境、海洋水體、深海沉積物以及甲烷水合物區(qū)的固氮基因nifH的研究，極大地豐富了人們的視野，加深了對固氮微生物和氮循環(huán)重要性的認識，使人類對固氮微生物的了解從膚淺走向深入。

固氮酶橫跨古菌域和細菌域，分布極其廣泛，說明固氮功能在微生物中普遍存在，同時也說明這一功能的重要性。固氮基因廣泛存在但是進化上卻具有保守性，為采用PCR技術(shù)擴增固氮基因nifH、分析環(huán)境中大量存在的不可培養(yǎng)的固氮微生物奠定了基礎(chǔ)。隨著研究的深入，對NifH系統(tǒng)發(fā)育多樣性的認識也逐步增加。2003年，Zehr等[3］通過構(gòu)建 NifH 和16S rRNA系統(tǒng)進化樹對固氮基因和微生物種群進行比較，認為固氮基因和固氮微生物種類存在一定程度上的一致性，在系統(tǒng)發(fā)育樹上可以找出一一對應關(guān)系。

早期的研究認為，nifH基因基本上有4個Cluster，Cluster I基因主要來自α－變形菌綱、β－變形菌綱、γ－變形菌綱、藍細菌以及γ－變形菌綱的vnfH 基因；ClusterⅡ是產(chǎn)甲烷微生物的固氮酶和細菌anfH基因；ClusterⅢ是厭氧細菌的固氮酶基因，例如梭菌（G＋C含量低，G＋）、硫還原細菌（δ－變形菌綱）；ClusterⅣ是各種來自古菌的固氮酶基因，和16SrDNA的分類有一定的相似性[3，12］。

2003年，Mehta等[12］用nifH 基因的一對擴增引物：正向引物forward（5′－GGHAARGGHGGHATHGGNAARTC－3′，對應10～17位氨基酸 GKGGIGKS，是鐵蛋白上ATP的結(jié)合位點）和反向引物reverse（5′－GGCATNGCRAANCCVCCRCANAC－3′，對應132～139位氨基酸VCGGFAMP，包含4Fe－4S簇配位體上的半胱氨酸），從深海和熱液噴口獲得的77個NifH，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示也分成4個簇。

2004年，Steward等[13］用兩對引物：CDHPnif53F（5′－TGAGACAGATAGCTATYTAYGGHAA－3′）和CDHPnif723R（5′－GATGTTCGCGCGGCACGAADTRNATSA－3′），以及nifH2（5′－TGYGAYCCNAARGCNGA－3′）和 nifH1（5′－ADNGCCATCATYTCNCC－3′），進行巢氏PCR擴增，獲得228條序列；以獲得的序列加上當時GenBank中的219條序列，共447條序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示出一支獨立于已知4個Cluster的深海簇（Deep branches）。

2009年，Dang等[14］用Mehta設(shè)計的固氮基因引物[12］對鄂霍次克海水合物區(qū)2個站位的沉積物樣品進行擴增，克隆出的nifH基因多樣性更加豐富，其中新分離出的ClusterⅤ是當時該地區(qū)特有的固氮基因簇。

2013年，Dang等[15］還是用同一對固氮基因引物，對中國南海從幾百米到上千米深度不同的12個站位沉積物樣品進行擴增，獲得1110個不同的DNA序列，分別屬于α－變形菌綱、β－變形菌綱、γ－變形菌綱、δ－變形菌綱、厚壁菌門、綠菌綱、擬桿菌門、疣微菌門和廣古菌門，這些序列與已知序列的相似性為40.1%～100%。此次南海nifH擴增分出了9個大的Class，體現(xiàn)了固氮微生物更高的多樣性[15］。

3 不同海洋生態(tài)環(huán)境的微生物固氮

微生物通過固氮為海洋提供了大量的新氮。2002年，估算的全球海洋氮固定能力為100～200Tg N·a－1，即每年100×1012～200×1012g N[16］。這些清潔氮源對維持海洋初級生產(chǎn)力具有重要意義。分子生態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，從表層海水到大洋深處沉積物，固氮微生物的類群分布具有一定規(guī)律，并不是雜亂隨機的。真光層上部表層水體中分布的是自由生活或內(nèi)共生的藍細菌門和γ－變形菌綱；靠近表層出現(xiàn)的多是α－、β－、γ－、δ－變形菌綱和綠菌門；海洋水體深處中存在的一般是α－、γ－變形菌綱以及古菌；海草和鹽沼生態(tài)系統(tǒng)中常為變形菌綱、厚壁菌門；沉積物中主要是變形菌綱，深海沉積物中還擴增得到眾多古菌[17］。

3.1 深海的固氮微生物

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)海底的冷泉、熱泉、火山口和水合物區(qū)都存在高密度的微生物。對這些地區(qū)固氮微生物的探索主要采用分子生物學方法。2005年開展的深海調(diào)查計劃 Leg 201of the Ocean Drilling Program at Site 1230，在鄰近水合物區(qū)的沉積物柱狀樣品中發(fā)現(xiàn)了由微生物群落支持的生態(tài)系統(tǒng)，分離出了可能的固氮微生物Rhizobia和Vibrio diazotrophicus[18］。

Mehta等[12］用固氮基因引物擴增位于太平洋東北部胡安德富卡洋中脊（Juan de Fuca Ridge）附近的Axial Volcano和Puffer兩個受火山活動影響的熱液噴口，得到約400bp長的固氮基因片段，從系統(tǒng)進化關(guān)系分析得出主要的nifH克隆分布在ClusterⅡ、ClusterⅢ和ClusterⅣ三個簇。這表明深海熱液環(huán)境固氮基因具有多樣性，又因為其獨特的地理位置而具有特殊性。而所有來自深海樣品的nifH基因都與嗜熱的厭氧古菌Methanococcus thermolithotrophicus有77%～83%的一致性，表明深海熱液噴口nifH基因有兩個來源，一個是厭氧高溫海床，另一個是冷的富氧深水[12］。

對深海水合物環(huán)境中的固氮微生物研究，將海底的氮循環(huán)、碳循環(huán)以及硫循環(huán)緊密聯(lián)系在一起。水合物區(qū)的厭氧甲烷氧化古菌（Anaerobic methane oxidizing archaea，ANME）和硫還原細菌（Sulfate－reducing bacteria，SRB）之間廣泛存在合作共生關(guān)系[19］。甲烷氣體的溫室作用比CO2更強，ANME和SRB的共生關(guān)系減少了甲烷氣體從海洋向大氣的釋放，也正由于這種共生關(guān)系使得ANME至今不能純培養(yǎng)，只能采用分子手段研究其生理生化特點[19］。淺表水合物支撐深海環(huán)境中生物群落和生產(chǎn)力，這種生態(tài)系統(tǒng)對氮源有大量需求?；瘜W分析表明，硝酸鹽和亞硝酸鹽在深海熱液噴口處濃度僅為40μmol·L－1，在高于30℃的還原性水體中更加缺乏，而氨在深海和冷泉的濃度小于1μmol·L－1，海洋中最大的氮源是氮氣，在深海中濃度能達到0.59mmol·L－1[20］。微生物固氮能給碳源豐富、氮源缺乏的甲烷溢出環(huán)境提供氮源。深海Eel River Basin海盆固氮酶宏基因組研究發(fā)現(xiàn)，主要的固氮酶來自Deltaproteobacteria和Methanosarcina，隨后直接標記檢測證明ANME和SRB甲烷氧化共生體存在固氮能力，這一發(fā)現(xiàn)說明這兩類微生物對深海水合物區(qū)新氮的輸入具有重要作用，固氮是一個普遍現(xiàn)象，甲烷氧化聯(lián)合體（Methane－oxidizing consortia）可能直接參與了氮固定[19］。從甲烷溢出環(huán)境分離到的甲烷氧化古菌（GenBank：AB362194）基因上含有一個固氮酶操縱子，支持了甲烷氧化聯(lián)合體固氮假說[19］。目前的數(shù)據(jù)表明ANMEs被分成3種系統(tǒng)發(fā)育類型，其中 ANME－2、ANME－3與δ－變形菌綱的SRB微生物形成共生，ANME－1則單獨進行甲烷氧化[21－25］。

Dang等[14］對鄂霍次克海水合物區(qū)沉積物固氮酶進行PCR擴增表明，這一地區(qū)有著獨特的nifH 基因，并且大部分的序列來自于沒有培養(yǎng)的和未知的細菌或古菌。用 PCoA（Principal coordinates analysis）分析熱液噴口、深海甲烷溢出環(huán)境和海水的固氮微生物群落結(jié)構(gòu)表明，表面海水、熱液噴口附近、水合物區(qū)的固氮微生物是3個差異很大的群落，進一步表明環(huán)境特點強烈影響到固氮微生物的群落組成和結(jié)構(gòu)。

3.2 近海的固氮微生物

微生物固氮的同時吸收CO2，因此固氮影響著海洋碳的輸入輸出。了解海洋固氮微生物對定性和定量預測固氮對碳循環(huán)和全球碳變化的影響十分重要[26］。地表徑流以及大氣沉降[27，28］攜帶各種物質(zhì)進入海洋，包括高濃度的無機氮和各種微量元素等，再加之近岸海水較淺、有利于光合作用等因素，使得靠近大陸的海洋微生物豐度和多樣性比深?；蚬褷I養(yǎng)海域都更加豐富。對近?；蛘叽箨戇吘壓５墓痰芯浚芯繉ο蠡痉譃樗w和沉積物，這是兩種完全不同的固氮生態(tài)環(huán)境。海水中的氮固定以固氮藍細菌為主導[27］，特別是單細胞固氮藍細菌巨大固氮能力的發(fā)現(xiàn)[29，30］，改變了以Trichodesmium為主研究海洋水體固氮的格局。

近海和河口地區(qū)一般被看作是由反硝化作用造成的氮凈損失區(qū)[31］，營養(yǎng)鹽特別是銨鹽豐富，對固氮有抑制作用[32］，因此有學者認為這些地區(qū)固氮作用不是十分重要。但是在海草生長區(qū)、珊瑚礁、紅樹林等海域，甚至是這些生態(tài)區(qū)外的沉積物固氮研究顯示固氮作用是存在的[33］，如果忽略這些確實存在的固氮作用，那么就很難正確研究近海的氮平衡問題。

紅樹林、珊瑚礁和海草床等是近岸海洋生態(tài)功能區(qū)，也是固氮研究的熱門區(qū)域。紅樹林能起到防風防浪的作用，是有重要防護作用的熱帶和亞熱帶海洋生態(tài)系統(tǒng)。我國沿岸的這些生態(tài)功能區(qū)基本處于不健康或者亞健康狀態(tài)[34］。Zhang等[35］對我國三亞地區(qū)紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中的固氮微生物采用不依賴于培養(yǎng)的PCR－DGGE（Denaturing gradient gel electrophoresis）技術(shù)進行研究，發(fā)現(xiàn)主要的固氮微生物類群為：Azotobacter、Desulfuromonas、Sphingomonas、Geobacter、Pseudomonas、Bradyrhizobium 和Derxia；CCA（Ca－nonical correspondence analysis）分析顯示有機碳和鉀是影響微生物群落分布的主要因素。Dias等[36］對巴西圣保羅州的兩個紅樹林生態(tài)區(qū)（其中一個受石油開采影響、另一個不受影響）進行固氮基因nifH 的研究，發(fā)現(xiàn)這兩個地區(qū)的nifH的豐度相當，但是物種分布不同，與石油污染的影響有關(guān)。Vovides等[37］對位于墨西哥南下加利福尼亞州的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)進行調(diào)查，通過乙炔法測定保護區(qū)、重新種植區(qū)、自然生長區(qū)、遭受破壞區(qū)四種狀態(tài)下的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中的淤泥微生物固氮作用，發(fā)現(xiàn)未受破壞的三種紅樹林生態(tài)系統(tǒng)之間的固氮差異不顯著（39～47mg N·m－2·a－1），但與遭受破壞的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)比較差異顯著，是遭受破壞的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)固氮能力的7～8倍；遭受破壞的紅樹林泥樣中較高的鹽度和pH值可能影響了微生物固氮作用，微生物固氮功能起到了指示紅樹林健康狀況的作用。

4 固氮作用研究的新視角

一直以來人們總是從緩解海洋環(huán)境氮限制角度探討微生物固氮作用，偏重于寡營養(yǎng)和遠洋海域的固氮作用研究。近年來隨著研究的深入，人們逐漸意識到固氮作用對近岸環(huán)境也具有重要的生態(tài)學意義，從新的視角開展了固氮研究。

4.1 固氮微生物對環(huán)境的指示作用

沉積物質(zhì)量的改變必將影響棲居其中的微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性以及活性。例如紅樹林毀壞后，鹽度和pH值升高使微生物固氮活力下降，固氮微生物起到了指示紅樹林健康狀況的作用[37］。史氏甲烷短桿菌（Methanobrevibacter smithii）是廣泛生活在人腸道中的產(chǎn)甲烷廣古菌，環(huán)境再生長的可能性很低，擁有獨特的nifH 基因，2011年，Johnston等[38］用該古菌的nifH基因指示水體污染，論證了這一方法的可行性。這些研究都提到了固氮微生物的環(huán)境指示作用，為固氮微生物研究提供了新思路。

4.2 富營養(yǎng)環(huán)境固氮微生物的研究意義

在人類活動影響氮循環(huán)之前，氮元素一直是生物生長的限制因素?；使I(yè)的出現(xiàn)和發(fā)展推動了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，卻人為地加快了氮固定的速率，加速更多不可利用的無機氮轉(zhuǎn)化成生物可利用的氨，人類對空氣中氮的固定超過了地球自然固氮的總和[39］。過量使用化肥導致可溶解的氮營養(yǎng)鹽隨著雨水沖刷和陸地徑流最終進入到海洋，必將打破原有的氮循環(huán)平衡狀態(tài)。接踵而來的是受全球氮循環(huán)改變引起的一系列危機，例如：對海洋特別是近岸海域原有固氮作用和氮循環(huán)的相關(guān)微生物產(chǎn)生重要的影響，導致生物多樣性發(fā)生變化；外源營養(yǎng)鹽增多，導致生物固氮能力降低，同時對CO2的固定能力降低，最終使得氣候變暖；氮鹽輸入經(jīng)常引起水體富營養(yǎng)化，使得水質(zhì)變差，威脅水生生物生長甚至死亡，這些后果都將造成人類生存危機[40］。也使得近岸富營養(yǎng)化海域的固氮微生物生態(tài)研究呈現(xiàn)出新的意義。

5 結(jié)語

固氮微生物和固氮基因在海洋環(huán)境中廣泛存在，種類豐富。近年來人們應用新技術(shù)從多角度多方位對海洋固氮作用進行研究，發(fā)現(xiàn)固氮基因分布和環(huán)境因子具有相關(guān)性，對環(huán)境具有一定的指示意義，但是相關(guān)研究仍然欠缺。對近岸海洋固氮作用的研究揭示了近海固氮存在的一些區(qū)別于傳統(tǒng)觀念的現(xiàn)象，使得人們重新認識固氮微生物的生態(tài)作用，同時開辟了固氮基因分子生態(tài)學研究的新視角。

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