培養(yǎng)法和染色法對養(yǎng)殖環(huán)境中微生物氣溶膠濃度的檢測

劉暢

(鞍山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，遼寧 鞍山 114006)

大氣氣溶膠當(dāng)中，生物氣溶膠是其中具有活性的部分，包括細(xì)菌、真菌以及病毒等等，其以空氣為介質(zhì)進(jìn)行傳播和擴(kuò)散，從而引發(fā)人類的急性、慢性疾病，例如傳染、中毒、過敏或者植物疾病的流行以及傳播。畜禽舍環(huán)境當(dāng)中所產(chǎn)生的微生物氣溶膠不僅將對畜禽以及相關(guān)人員的健康帶來危害，同時也將對外界的環(huán)境帶來污染。許多重大畜禽類型的傳染病將是通過氣溶膠進(jìn)行傳播的。

微生物氣溶膠濃度檢測可使用多種方法，傳統(tǒng)的方法是培養(yǎng)之后的菌落技術(shù)，當(dāng)前，隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)步，可使用DNA染色后直接鏡檢技術(shù)以及熒光原位雜交、定量PCR技術(shù)等等，當(dāng)前最常用的是培養(yǎng)后的菌落技術(shù)，然而該方法無法對微生物的實際含量進(jìn)行準(zhǔn)確地計算，根據(jù)實際的報道可了解，僅有0.3%～10%的微生物能夠被培養(yǎng)。DAPI染色法已經(jīng)被認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)的檢測浮游生物總量的方法，同時其操作較為簡便，能保證技術(shù)的準(zhǔn)確性。

一 試驗材料以及試驗方法

1.采集樣品

本實驗分別對1個豬舍、2個雞舍、2個牛舍進(jìn)行了檢測，通過將國際標(biāo)準(zhǔn)AGI-30空氣采樣器放置在畜禽舍的中間，使其離地約為1.0m，以50m l的無菌生理鹽水為采樣介質(zhì)，采樣過程當(dāng)中的氣流速度為12.5L/min，驅(qū)動時間為20min。在采樣的過程中同時對舍內(nèi)的溫?zé)嶂笜?biāo)進(jìn)行記錄。

2.培養(yǎng)計數(shù)法

取25ml空氣采樣液進(jìn)行搖勻，而后將采樣液均勻分為三份，一份以包含有50mL/L綿羊血的營養(yǎng)瓊脂作為培養(yǎng)基，從而實現(xiàn)需氧細(xì)菌的培養(yǎng)，而另一份則依舊包含體積分?jǐn)?shù)為5%的綿羊血的營養(yǎng)瓊脂作為培養(yǎng)基，從而實現(xiàn)厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)。而第三份則以沙保弱作為培養(yǎng)基，從而實現(xiàn)真菌的培養(yǎng)，每個樣品重復(fù)三次。細(xì)菌在恒溫37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h后開始計數(shù)，真菌在恒溫25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7d后進(jìn)行技術(shù)，校正之后用于生物氣溶膠濃度的計算。

3.DNA染色后計數(shù)

通過預(yù)先經(jīng)過鉻酸浸泡以及高壓滅菌處理之后的25mL采樣液放入50mL玻璃瓶當(dāng)中，隨后加入5mL福爾馬林，再加入7.5mL DAPI染液，而后將采樣液置于暗室中染色10min，最后在低于0.07大氣壓狀況下使用硝酸纖維濾膜抽濾采樣液，抽干之后取出硝酸纖維濾膜，將其置于滴上鏡油的載玻片上進(jìn)行計數(shù)。每一個細(xì)胞代表一個微生物氣溶膠粒子。

二 試驗分析

1.DAPI染色后的計數(shù)結(jié)果

使用DAPI染色法所測試得出的不同養(yǎng)殖環(huán)境下的微生物氣溶膠濃度如下圖所示:

畜禽舍(編號)不同計數(shù)方法微生物的濃度AGI-30/(105 cfu/m3) DAPI染色(106 cell/m3) Median Max Min Median Max Min雞舍A 38.9 67.2 13.8 166 325 19.2雞舍B 27.1 43.3 14.7 166 275 8.90豬舍C 26.3 40.1 15.6 136 228 5.55牛舍D 2.09 3.08 1.14 8.36 15.7 0.93牛舍E 5.92 83.2 3.07 37.3 59.3 10.4

不同養(yǎng)殖環(huán)境下的微生物氣溶膠濃度為166×106、166×106、136×106、0.836×106、3.73×106個/m3空氣。通過在熒光顯微鏡下觀察可了解到，每個視野當(dāng)中被染色的微生物最合適的數(shù)量為30～60個，過多或者過少都將導(dǎo)致計數(shù)產(chǎn)生偏差。由此，在顯微鏡觀察之前應(yīng)將采樣液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專瑫r抽濾過程中選擇合適的樣品數(shù)量。

2.培養(yǎng)法測試得出的氣溶膠濃度

通過AGI-30采樣器對不同養(yǎng)殖環(huán)境內(nèi)的微生物氣溶膠濃度檢測結(jié)果分別為采樣器對2個雞舍、1個豬舍和2個牛舍38.9×105cfu/m3、27.1×105cfu/m3、26.3×105cfu/m3、2.09×105cfu/m3、5.92×105cfu/m3。對于雞舍A、B而言，在經(jīng)過AGI-30采樣器進(jìn)行樣品的采集之后，培養(yǎng)計數(shù)法所測試得出的濃度僅僅占據(jù)DAPI計數(shù)法所得出濃度的2.34%和1.63%，豬舍C、牛舍D、E所培養(yǎng)得出的微生物濃度占DAPI染色計數(shù)法得出濃度的1.93%，2.50%和1.59%。

三 結(jié)論

對于復(fù)雜的介質(zhì)而言，由于介質(zhì)當(dāng)中包括有使DNA粘連或者存在抑制酶反應(yīng)的物質(zhì)，從而導(dǎo)致DNA的克隆結(jié)果無法對真實的狀況進(jìn)行反映，通過使用熒光定量PCR技術(shù)，能實現(xiàn)對特定微生物含量計量的技術(shù)，然而該技術(shù)對試驗操作人員的要求較高，試驗的成本也較高，該種技術(shù)可對已知的特定微生物的定量定型分析進(jìn)行檢測。DAPI在染色后的直接熒光鏡計數(shù)操作較為簡單方便，無論是活細(xì)胞還是死細(xì)胞、殘核細(xì)胞都能清楚地檢測出來，從而得出了一個客觀真實的數(shù)據(jù)，是對某種環(huán)境下微生物總量檢測的較為便捷、快速有效的檢測方式。

在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境下，微生物氣溶膠來源以及成分都較為復(fù)雜，不同的微生物種類所需要培養(yǎng)的條件以及營養(yǎng)的成分都各有不同，由此，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式能培養(yǎng)出的微生物的數(shù)量以及種類都十分有限，同時，即使可培養(yǎng)的微生物也不一定能全部培養(yǎng)成功。由此，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法僅僅只能在一定的條件下實現(xiàn)對微生物的檢測，難以對微生物的實際狀況進(jìn)行分析和檢測，從而在很大程度上對試驗結(jié)果的分析和判斷造成了影響。

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