兩個(gè)海拔分布下紅砂葉片對(duì)滲透脅迫的生理響應(yīng)

李朝周，左麗萍，李毅，焦?。?/p>

（1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；3.慶陽(yáng)市經(jīng)濟(jì)林木工作管理站，甘肅 慶陽(yáng)745000；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

紅砂（Reaumuriasoongorica）是我國(guó)荒漠草場(chǎng)中的建群植物和優(yōu)勢(shì)植物，作為良好的荒漠草場(chǎng)牧草和維持綠洲穩(wěn)定性的重要植物之一，紅砂具有較高的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值［1－3］。有關(guān)紅砂滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、光合生理及生長(zhǎng)發(fā)育的研究已有報(bào)道［4－6］，但是關(guān)于紅砂在不同海拔及水分狀況下抗旱生理比較還缺乏系統(tǒng)研究。

在同一地域的不同海拔往往具有不同的生境因子，如不同的溫度、光照和降水等，這些不同會(huì)影響到植物本身的水分狀況、生長(zhǎng)發(fā)育和抗性生理。當(dāng)植物遭受到干旱脅迫時(shí)，植物細(xì)胞往往受到一定程度的滲透脅迫，并造成植物組織及細(xì)胞失水，水勢(shì)和相對(duì)含水量下降，并有可能帶來(lái)細(xì)胞內(nèi)一系列的變化，如活性氧、自由基產(chǎn)生的增加、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的累積和細(xì)胞膜選擇透性的破壞等［7，8］?；钚匝酢⒆杂苫诘蜐舛认驴勺鳛榈诙攀?，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)代謝，但是當(dāng)活性氧的濃度超過(guò)一定“閾值”時(shí)，則能對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成傷害；當(dāng)然植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中也形成了清除活性氧、自由基的機(jī)制，如低分子的抗氧化劑與抗氧化酶系統(tǒng)，如抗壞血酸、還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶等［8，9］。近幾十年來(lái)，許多研究表明用PEG溶液進(jìn)行滲透脅迫可以在一定程度上模擬干旱脅迫，而處理方式除對(duì)整體植物進(jìn)行根系的PEG溶液滲透脅迫外，離體的葉片也被應(yīng)用于滲透脅迫，并具有處理均一和便于掌控脅迫程度的優(yōu)點(diǎn)，因此滲透脅迫在植物逆境生理研究中廣為采用［10－13］。

植物的抗旱性是由多種因素相互作用而構(gòu)成的一個(gè)復(fù)雜的綜合性狀，其中每一個(gè)因素都與抗旱性本質(zhì)之間存在著一定的聯(lián)系，而各因素之間也存在著一定的關(guān)聯(lián)。植物抵御或適應(yīng)干旱的途徑多種多樣，用單一指標(biāo)很難準(zhǔn)確評(píng)定植物的抗旱性，因此有必要探討滲透脅迫下抗性相關(guān)各生理指標(biāo)變化間的關(guān)聯(lián)。

為此，本實(shí)驗(yàn)以蘭州市九州臺(tái)山上、山下天然分布的紅砂枝條為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)用PEG－6000溶液滲透脅迫，測(cè)定其葉片在不同脅迫程度下相關(guān)生理指標(biāo)的變化及其關(guān)聯(lián)，探討不同海拔紅砂葉片對(duì)滲透脅迫生理響應(yīng)的差別及機(jī)制，旨在為干旱半干旱地區(qū)荒漠化防治及荒山造林實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

本實(shí)驗(yàn)所用材料取自蘭州市九州臺(tái)山上（海拔1 800m）、山下（海拔1 500m）自然生長(zhǎng)且3齡以上的紅砂植株，取生長(zhǎng)整齊一致的枝條，從各枝條頂端剪取10cm左右枝段插于PEG－6000溶液進(jìn)行滲透脅迫處理。PEG－6000溶液濃度分別為10%，20%，30%（質(zhì)量百分比濃度），以蒸餾水作為對(duì)照，于處理12和24h時(shí)，取其葉片進(jìn)行各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定。滲透脅迫處理在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，其溫度為（22±1）℃，相對(duì)濕度為55%，持續(xù)24h光照，光照強(qiáng)度為120μmol/（m2·s）。實(shí)驗(yàn)于2008年7－8月進(jìn)行，各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3～5次。

1.2 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.1 相對(duì)含水量（RWC） 烘干法［14］測(cè)定。

1.2.2 植物組織水勢(shì) 小液流法［14］測(cè)定。

1.2.3 自由水 （Vs）和束縛水 （Va）含量 參照郝再彬等［15］的方法測(cè)定。

1.2.4 丙二醛（MDA）含量 參照Benavides等［16］的方法測(cè)定。

1.2.5 脯氨酸含量 茚三酮比色法［14］測(cè)定。顯色后在520nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離脯氨酸含量。

1.2.6 可溶性糖含量 采用蒽酮比色法［14］測(cè)定。

1.2.7 O2－·產(chǎn)生速率 參照王愛(ài)國(guó)和羅廣華［17］的方法，測(cè)定環(huán)境中的光照強(qiáng)度為120μmol/（m2·s）。

1.2.8 抗氧化酶活性 超氧化物歧化酶（SOD）采用Spychalla和Desborough［18］的方法測(cè)定，用氮藍(lán)四唑法以抑制氯化硝基氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原50%為一個(gè)酶活性單位；過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用Lin和Wang［19］的方法。其中POD活性測(cè)定基于愈創(chuàng)木酚的氧化，在470nm測(cè)定，以每克植物鮮重中每分鐘所含酶活性單位（U）表示；過(guò)氧化氫酶（CAT）活性用紫外吸收法，以240nm每分鐘光吸收值減少0.01為一個(gè)酶活性單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及相關(guān)性分析，取P＜0.05為顯著相關(guān)，P＜0.01為極顯著相關(guān)。各數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 滲透脅迫對(duì)紅砂葉片水分生理特征的影響

蘭州市九州臺(tái)山上及山下紅砂葉片相對(duì)含水量和水勢(shì)都隨PEG－6000處理時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫程度的加強(qiáng)呈下降趨勢(shì)（表1）。在30%的PEG處理12h時(shí)，山上、山下紅砂葉片相對(duì)含水量分別比對(duì)照降低了48.94%，28.22%，處理24h時(shí)分別下降了57.96%，47.72%。在30%的PEG處理12h時(shí)山上、山下紅砂葉片水勢(shì)分別比對(duì)照降低了0.13和0.88MPa，在處理24h時(shí)分別降低了0.26和1.01MPa?？梢?jiàn)，山下生長(zhǎng)的紅砂在受脅迫時(shí)持水能力較好。

表1 PEG－6000處理下紅砂葉片相對(duì)含水量及水勢(shì)變化Table 1 Changes in leaf relative water content and water potential of R.soongoricaunder PEG－6000treatment

隨著PEG－6000滲透脅迫程度的加強(qiáng)和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，紅砂葉片自由水含量逐漸減少，束縛水含量增多，自由水/束縛水的值不斷減小（表2）。用濃度30%的PEG處理12h時(shí)，山上、山下紅砂自由水/束縛水的值分別比對(duì)照降低了0.94，0.60；處理24h時(shí)分別下降了1.00，0.60。由此可見(jiàn)山下紅砂比山上紅砂有更強(qiáng)的耐滲透脅迫的能力。

表2 PEG－6000處理下紅砂葉片自由水、束縛水及自由水/束縛水的變化Table 2 Changes in leaf Vs，Va and Vs/Va of R.soongoricaunder PEG－6000treatment

2.2 滲透脅迫對(duì)紅砂葉片MDA含量的影響

蘭州市九州臺(tái)山上、山下紅砂葉片MDA含量隨PEG滲透脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫程度的加強(qiáng)呈上升趨勢(shì)，但上升的趨勢(shì)不同（圖1），用濃度30%的PEG處理12h時(shí)，山上、山下紅砂葉片MDA含量分別比對(duì)照提高了3.24和1.67μmol/g，處理24h時(shí)分別提高了4.08和2.88μmol/g。由此可見(jiàn)，山上紅砂葉片在受到滲透脅迫時(shí)，膜脂過(guò)氧化程度比山下紅砂葉片更為嚴(yán)重。

2.3 滲透脅迫對(duì)紅砂葉片O2－·產(chǎn)生速率的影響

隨PEG滲透脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫程度的加強(qiáng)，蘭州市九州臺(tái)山上、山下紅砂葉片O2－·產(chǎn)生速率呈不斷增大趨勢(shì)，但增大的程度不同，用濃度30%的PEG處理12h時(shí)，山上、山下紅砂葉片O2－·產(chǎn)生速率分別比對(duì)照增大了174.94和167.93μmol/（min·g FW）；處理24h時(shí)分別增大了179.80和169.30μmol/（min·g FW）（圖2）。

圖1 PEG－6000處理對(duì)紅砂葉片丙二醛含量的影響Fig.1 Effect of PEG－6000treatment on MDA content in R.soongoricaleaf

圖2 PEG－6000處理對(duì)紅砂葉片O2－·產(chǎn)生速率的影響Fig.2 Effect of PEG－6000treatment on generating rate of O2－·in R.soongoricaleaf

2.4 滲透脅迫對(duì)紅砂葉片抗氧化酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在PEG滲透脅迫下紅砂葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性均高于對(duì)照，且隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫程度的加強(qiáng)呈不斷增加趨勢(shì)；清除H2O2的2種重要的酶CAT和POD變化基本一致，在處理12h時(shí)，隨PEG濃度的升高，POD和CAT活性升高，但在處理24h時(shí)，隨PEG濃度的升高，POD和CAT活性先升高后降低（圖3）。SOD是一種誘導(dǎo)酶，受到底物濃度的誘導(dǎo)，說(shuō)明干旱促進(jìn)紅砂葉片O2－·的生成，誘導(dǎo)SOD活性增加，由SOD歧化O2－·產(chǎn)生的H2O2也必然增多，在脅迫后期POD和CAT活性均下降。

圖3 PEG－6000處理對(duì)紅砂葉片SOD、POD和CAT活性的影響Fig.3 Effect of PEG－6000treatment on SOD，POD and CAT activity in R.soongoricaleaf

2.5 滲透脅迫對(duì)紅砂葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

蘭州九州臺(tái)山上、山下紅砂葉片在PEG滲透脅迫下脯氨酸含量變化趨勢(shì)相同（圖4），在不同PEG濃度滲透脅迫處理12h時(shí)山上、山下紅砂葉片脯氨酸含量均呈增加趨勢(shì)，處理24h時(shí)山上、山下紅砂葉片脯氨酸含量在PEG濃度為10%和20%時(shí)上升較快，而PEG濃度為30%時(shí)有所下降。山下紅砂葉片脯氨酸含量變化較為劇烈。隨滲透脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫程度的加強(qiáng)，紅砂葉片可溶性糖含量不斷的增加，但增加趨勢(shì)不同，10%的PEG處理紅砂葉片可溶性糖含量比對(duì)照變化較小，但高濃度的PEG處理下的紅砂葉片可溶性糖含量變化較大。隨著脅迫的進(jìn)行，蘭州九州臺(tái)山下紅砂葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)隨脅迫進(jìn)行變化較為劇烈。

2.6 滲透脅迫下紅砂葉片生理特征的相關(guān)性

滲透脅迫下，蘭州市九州臺(tái)山上、山下紅砂葉片水分指標(biāo)RWC、水勢(shì)及自由水/束縛水均與MDA、O2－·產(chǎn)生速率、SOD活性和可溶性糖呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（表3）；MDA與SOD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)；O2－·產(chǎn)生速率與SOD活性呈顯著正相關(guān)，其余相關(guān)關(guān)系不顯著。

3 討論

束縛水含量是植物耐旱性的一個(gè)重要指標(biāo)。束縛水比例增大，則細(xì)胞原生質(zhì)粘滯性及原生質(zhì)膠體親水性加強(qiáng)，有利于植物吸水和保持體內(nèi)水分，對(duì)提高植物耐旱能力有利，即自由水/束縛水（Va/Vs）小，則植物耐旱能力強(qiáng)［20］。本研究顯示蘭州市九州臺(tái)山下紅砂葉片相對(duì)含水量雖然低于山上的紅砂（表1），但自由水/束縛水下降（表2），這與不同海拔造成的氣候條件和干旱程度密切相關(guān)，也可能是本研究探討的不同海拔紅砂葉片對(duì)滲透脅迫生理反應(yīng)差異的重要原因。

圖4 PEG－6000處理對(duì)紅砂葉片脯氨酸及可溶性糖含量的影響Fig.4 Effect of PEG－6000treatment on proline and soluble sugar content in R.soongoricaleaf

表3 PEG－6000處理下紅砂葉片生理特征的相關(guān)性Table 3 Correlations among physiological indexes of R.soongoricaleaf under PEG－6000treatment

滲透調(diào)節(jié)是植物應(yīng)對(duì)水分脅迫的重要措施。有研究顯示檉柳屬（Tamarix）植物水勢(shì)越低，持水力越強(qiáng)，抗旱性越強(qiáng)［21］。本研究的結(jié)果表明，滲透脅迫導(dǎo)致紅砂葉片自由水含量、水勢(shì)和相對(duì)含水量降低（表1），但九州臺(tái)山上生長(zhǎng)的紅砂由于其葉片束縛水含量相對(duì)較高（表2），隨PEG滲透脅迫的加深表現(xiàn)出了較強(qiáng)的保水能力，如在30% 的PEG－6000溶液滲透脅迫24h山上紅砂葉片含水量比山下紅砂高（表1）。

植物在逆境條件下的膜脂過(guò)氧化反應(yīng)和保護(hù)酶系統(tǒng)SOD、POD、CAT等活性的變化已廣泛應(yīng)用于植物對(duì)逆境的反應(yīng)機(jī)理研究［22］。MDA是植物細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，其含量的高低在一定程度上能反映膜脂過(guò)氧化水平和膜結(jié)構(gòu)的受害程度。一般認(rèn)為植物在脅迫條件下細(xì)胞膜的受損與超氧自由基增加引起膜脂過(guò)氧化有關(guān)［9，22，23］。SOD、CAT和POD等酶類(lèi)是細(xì)胞抵御活性氧傷害的重要保護(hù)酶，它們?cè)谇宄踝杂苫⑦^(guò)氧化氫和過(guò)氧化物以及阻止或減少自由基產(chǎn)生等方面起著重要作用［9］。超氧化物歧化酶以催化O2－·發(fā)生歧化作用起到清除O2－·的解毒作用，超氧化物歧化酶將O2－·歧化產(chǎn)生的H2O2由細(xì)胞內(nèi)CAT和POD清除。脅迫條件下保護(hù)酶系統(tǒng)活性上升和下降與植物的抗旱性強(qiáng)弱有關(guān)?？购祻?qiáng)的品種在逆境條件下能使保護(hù)酶活力維持在一個(gè)較高水平，有利于清除自由基，降低膜脂過(guò)氧化水平，從而減輕膜傷害程度［16］。本研究表明，PEG滲透脅迫導(dǎo)致紅砂葉片MDA含量增多，在PEG滲透脅迫下SOD，POD和CAT活性增強(qiáng)，上述結(jié)果說(shuō)明滲透脅迫一方面刺激紅砂葉片產(chǎn)生更多的自由基，加快脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA含量增加，另一方面刺激了保護(hù)酶系統(tǒng)（SOD、POD和CAT）活性的增強(qiáng)，加快自由基的清除，減輕膜脂過(guò)氧化程度。在PEG溶液的滲透脅迫下，紅砂葉片水分虧缺隨PEG脅迫加劇而逐漸加重，水勢(shì)不斷的降低（表1），由此造成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）積累（圖1），O2－·產(chǎn)生速率的大幅度增加（圖2），從而誘發(fā)超氧化物歧化酶（SOD）活性增強(qiáng)（圖3a）。在適度脅迫下，植物對(duì)環(huán)境脅迫做出響應(yīng)，POD和CAT活性增強(qiáng)（圖3b～c），脯氨酸和可溶性糖含量增加（圖4a～b），但進(jìn)一步脅迫導(dǎo)致POD和CAT活性下降（圖3b～c），紅砂葉片內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)平衡破壞。PEG滲透脅迫下，蘭州市九州臺(tái)山上、山下紅砂葉片滲透脅迫下各生理變化相關(guān)分析表明，紅砂葉片水分指標(biāo)RWC、水勢(shì)及自由水/束縛水均與MDA含量及O2－·產(chǎn)生速率呈顯著負(fù)相關(guān)；SOD活性與O2－·產(chǎn)生速率呈顯著正相關(guān)（表3），可見(jiàn)滲透脅迫下各生理指標(biāo)的變化密切關(guān)聯(lián)。

總之，對(duì)于九州臺(tái)山上和山下生長(zhǎng)的2組材料，在PEG脅迫加深的條件下，山下的紅砂葉片具有較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力，其脂質(zhì)過(guò)氧化的水平也較低，產(chǎn)生這些生理響應(yīng)差別的主要因素可能為2組材料水分狀況的差別，即山下紅砂葉片束縛水含量較高，在深度脅迫下的保水性較好，且在通常情況下較低的葉片含水量和水勢(shì)也可能是其較強(qiáng)抗?jié)B透脅迫能力的重要原因之一。

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