HDACI、8在肺泡II型上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的表達(dá)及意義

姜巍，徐國(guó)萍

（1.大理學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

HDACI、8在肺泡II型上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的表達(dá)及意義

姜巍1，徐國(guó)萍2*

（1.大理學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

目的：觀察TGF-β1作用下，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞RLE-6TN在EMT過(guò)程中HDAC1、8的表達(dá)情況及TSA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的影響。方法：將TGF-β1加入到體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，于不同時(shí)間收取細(xì)胞，采用WB及Real-time RT-PCR檢測(cè)HDAC1、8及E-cad、α-SMA的表達(dá)情況。然后將TGF-β1加入經(jīng)過(guò)TSA預(yù)處理的細(xì)胞中，于不同時(shí)間收取細(xì)胞，重新檢測(cè)上述基因。結(jié)果：加入TGF-β1后，E-cad蛋白表達(dá)下調(diào)；α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)；HDAC1蛋白表達(dá)上調(diào)；HDAC8蛋白表達(dá)下調(diào)。E-cad mRNA表達(dá)下調(diào)α-SMA及HDAC8的mRNA均于12 h表達(dá)上調(diào)，6 h、24 h表達(dá)下調(diào)；HDAC1 mRNA表達(dá)于6 h下調(diào)，24 h上調(diào)。加入TSA后，E-cad蛋白表達(dá)上調(diào)；α-SMA、HDAC1及HDAC8蛋白的表達(dá)均下調(diào)。E-cad mRNA表達(dá)上調(diào)；α-SMA mRNA表達(dá)于6 h、12 h上調(diào)，24 h下調(diào)；HDAC1 mRNA表達(dá)下調(diào)；HDAC8 mRNA表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：TGF-β1體外誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞EMT，可以通過(guò)應(yīng)用TSA抑制其獲得α-SMA表型、失去E-cad表型，從而部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮EMT。

HDAC1；TGF-β1；TSA；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；EMT

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是各種間質(zhì)性肺疾病所引起的慢性肺部疾病的共同結(jié)局，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。與其他器官纖維化一樣，PF涉及到細(xì)胞、細(xì)胞因子、EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition）等的共同參與〔1〕。EMT是指上皮細(xì)胞失去其特有的表型（E-cad），獲得新的表型（α-SMA），轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞。EMT參與調(diào)控器官的發(fā)生和其它生理病理過(guò)程，包括器官纖維化。組蛋白去乙?；福℉DACs）也在這些相關(guān)的過(guò)程中起著重要作用〔2〕。HDACs是平衡染色質(zhì)重塑中組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）乙?；顒?dòng)的酶類(lèi)，二者間平衡在特定條件下被破壞，就會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的失調(diào)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變，從而引起基因表達(dá)異常，這種異常在纖維化和癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用〔3〕。近年的研究表明，HDAC1在TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔2〕，但是HDAC是否參與了肺泡上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程目前尚不清楚。本研究擬通過(guò)在體外培養(yǎng)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中加入TGF-β1，觀察HDAC1、8和E-cad、α-SMA的表達(dá)情況，然后加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA，觀察其對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的影響，探討HDAC1、8在肺泡上皮細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用及其機(jī)制，為肺纖維化的治療開(kāi)辟一條嶄新道路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)SV40永生化大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞系RLE-6TN購(gòu)自美國(guó)ATCC，細(xì)胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑TGF-β1購(gòu)自R&D公司，單克隆抗E-cadherin抗體購(gòu)自BD公司，單克隆抗α-SMA抗體及TSA購(gòu)自Sigma公司，多克隆抗HDAC1、8抗體購(gòu)自Proteintech Group公司，引物采用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，RT-PCR Kit購(gòu)自大連Takara公司。

1.1.3 主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司，USA），相差顯微鏡（Nikon，Japan），垂直式電泳儀及半干式轉(zhuǎn)移儀（BIO-RAD），7900HT Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystem，USA）。

1.2 方法

1.2.1 觀察TGF-β1作用下，細(xì)胞的E-cad、α-SMA、HDAC1及HDAC8的表達(dá)情況

1.2.1.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為：空白對(duì)照組、TGF-β1（3 ng/mL）誘導(dǎo)組。

1.2.1.2Western blot檢測(cè)當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%~ 80%融合后加入含0.5%FBS的靜止液同步化作用24 h，換成含TGF-β1（3 ng/mL，下同）的靜止液分別作用0、12、24、48、72 h后裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測(cè)定濃度后取40 μg樣品進(jìn)行10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠變性電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入一抗，37℃1 h，4℃過(guò)夜。洗滌后加二抗，室溫45 min，加入發(fā)光液后封膜、顯影。掃描圖像結(jié)果，并用Quantity-One軟件計(jì)算灰度值。

表1 RT反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)體系

1.2.2 觀察HDACi對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT的影響

1.2.2.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為：空白對(duì)照組、TGF-β1組、TSA組及TSA與TGF-β1共用組。

1.2.2.2Western blot檢測(cè)當(dāng)細(xì)胞同步化作用24 h后，于新鮮靜止液中加入TSA（300 nM，下同）預(yù)處理6 h，而后加入TGF-β1，余步驟同1.2.1.2。

1.2.2.3Real-time RT-PCR檢測(cè)當(dāng)細(xì)胞同步化作用24 h后，于新鮮靜止液中加入TSA預(yù)處理6 h并加入TGF-β1，余步驟同1.2.1.3。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理多組比較采用單因素方差分析及Post Hoc檢驗(yàn)，用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對(duì)細(xì)胞EMT標(biāo)志物及HDAC1、8表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad蛋白表達(dá)下調(diào)，以48 h最明顯，為對(duì)照組的0.37倍（P<0.05）；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)，以48 h最明顯，為對(duì)照組的2.87倍（P<0.01）；HDAC1蛋白表達(dá)上調(diào)，以24 h最明顯，為對(duì)照組的1.28倍（P<0.01）；HDAC8蛋白表達(dá)上調(diào)，其中以72 h上調(diào)為對(duì)照組的1.19倍（P<0.01）最明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 TGF-β1對(duì)細(xì)胞EMT標(biāo)志物及HDAC的表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，E-cad mRNA的表達(dá)于6、12 h下調(diào)，分別為對(duì)照組的0.41倍、0.39倍，24 h上調(diào)，為對(duì)照組的1.1倍；α-SMA mRNA的表達(dá)于6、24 h下調(diào)，分別為對(duì)照組的0.79倍、0.88倍，12 h上調(diào)，為對(duì)照組的1.6倍；HDAC1 mRNA的表達(dá)6 h是下調(diào)的，為對(duì)照組的0.65倍，24 h是上調(diào)的，為對(duì)照組的1.3倍；HDAC8的表達(dá)于6、24 h下調(diào)，分別為對(duì)照組的0.68倍、0.95倍，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 TGF-β1對(duì)細(xì)胞EMT標(biāo)志物及HDAC1、8表達(dá)的影響

2.2 TSA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT的影響與對(duì)照組相比，加入TSA后，E-cad蛋白表達(dá)是上調(diào)的，以72 h為對(duì)照組的1.3倍（P<0.01）最為明顯α-SMA、HDAC1及HDAC8蛋白的表達(dá)均是下調(diào)的，其中α-SMA于24 h為對(duì)照組的0.70倍（P< 0.01）；HDAC1于12 h為對(duì)照組的0.78倍（P< 0.01）；HDAC8于24 h為對(duì)照組的0.45倍（P<0.01）最為顯著。見(jiàn)圖2。

圖2 TSA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT的影響

與對(duì)照組相比，加入TSA后，E-cad mRNA的表達(dá)是上調(diào)的，為對(duì)照組的3.83倍、2.78倍、1.67倍；α-SMA mRNA的表達(dá)于6、12 h上調(diào)，分別為對(duì)照組的1.53倍、1.18倍，24 h下調(diào)，為對(duì)照組的0.7倍；HDAC1 mRNA的表達(dá)是下調(diào)的，分別為對(duì)照組的0.92倍、0.58倍、0.38倍。HDAC8的mRNA表達(dá)是上調(diào)的，分別為對(duì)照組的1.64倍、2.33倍、1.8倍但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。

表4 TSA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT的影響

3 討論

肺間質(zhì)纖維化時(shí)，其病灶內(nèi)出現(xiàn)大量成肌纖維細(xì)胞（Myofibroblast，MFb）聚集，研究表明MFb是肺纖維化時(shí)主要的效應(yīng)細(xì)胞。MFb的來(lái)源除了肺內(nèi)固有的間充質(zhì)細(xì)胞外，部分來(lái)自肺泡上皮細(xì)胞的的間質(zhì)轉(zhuǎn)變〔1〕。TGF-β1是一種最主要的促纖維化因子，在EMT過(guò)程中起著重要作用〔4〕，且這種轉(zhuǎn)變是細(xì)胞內(nèi)不同信號(hào)通路整合的結(jié)果〔5〕。本實(shí)驗(yàn)中，加入TGF-β1后，E-cad表達(dá)下調(diào)，α-SMA表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞發(fā)生了EMT，這與文獻(xiàn)報(bào)道〔6〕一致。

在表觀遺傳學(xué)中，基因的表達(dá)調(diào)控包括磷酸化、甲基化和乙酰修飾化等，其中組蛋白乙?；腿ヒ阴；亲钪饕姆绞?，是基因表達(dá)的主要?jiǎng)恿Α?〕。HDAC1已經(jīng)被證明其在核小體組蛋白末端的去乙酰化作用中導(dǎo)致了組蛋白核心周?chē)腄NA被包裹得更加緊密，而這個(gè)結(jié)果反過(guò)來(lái)導(dǎo)致了基因轉(zhuǎn)錄的抑制〔8〕。有研究表明，HDAC1參與調(diào)控EMT，能夠抑制ZO-1和E-cad的啟動(dòng)子活性，并且在TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞EMT過(guò)程中是必須的〔2〕。本實(shí)驗(yàn)中加入TGF-β1后，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)變，在此過(guò)程中，觀察到HDAC1的表達(dá)上調(diào)，表明HDAC1可能通過(guò)抑制E-cad基因啟動(dòng)子活性參與TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過(guò)程。同時(shí)，當(dāng)肺泡上皮向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中，HDAC8表達(dá)上調(diào)并與α-SMA共表達(dá)與胞質(zhì)內(nèi)，呈細(xì)胞骨架樣分布〔9〕，這與有研究表明在前列腺組織中HDAC8只表達(dá)在間質(zhì)細(xì)胞及血管壁細(xì)胞中〔10〕的報(bào)道一致。

TSA是應(yīng)用最廣泛的HDACi，是一種非競(jìng)爭(zhēng)性可逆的HDAC活性抑制劑，可以抑制I類(lèi)和II類(lèi)HDAC〔11〕。本實(shí)驗(yàn)中，加入TSA后，HDAC1、8的表達(dá)均下調(diào)，證明了其對(duì)HDAC1、8的抑制性，這種抑制性是通過(guò)減少轉(zhuǎn)錄因子SP1的表達(dá)水平來(lái)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原在MFb上的表達(dá)〔12〕。正是由于TGF-β1的作用被抑制，從而抑制了EMT，這說(shuō)明TSA可以抑制細(xì)胞發(fā)生EMT。實(shí)驗(yàn)中加入TSA后，HDAC8的mRNA表達(dá)上調(diào)與蛋白表達(dá)不一致可能是由于蛋白在翻譯過(guò)程中部分修飾被抑制而mRNA的轉(zhuǎn)錄未被抑制有關(guān)，這種情況是否也發(fā)生在其它HDACi中以及具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，TGF-β1體外誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞EMT，可以通過(guò)應(yīng)用TSA部分逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而達(dá)到抑制EMT、降低肺纖維化發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的目的。而抑制HDAC1、8的活性將可能成為抗纖維化治療新的分子靶點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯 董杰）

Expression and Significance of Histone Deacetylase 1,8 in Alveolar Epithelial Type II Cells Mesenchymal Transition

JIANG Wei1,XU Guoping2*
（1.Clinical College,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000,China;2.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To observe the expression of histone deacetylase 1,8 on the process of TGF-β1 induced type II alveolar epithelial cells to EMT,and investigate the effect of TSA on TGF-β1-induced the cells EMT process.Methods:RLE-6TN cell lines were cultured and treated with TGF-β1,and collected cells at different time points.The expression of markers and mRNA of E-cad α-SMA，HDAC1 and HDAC8 were assayed by Western Blot and Real-time RT-PCR,respectively.Then add TGF-β1 to the cells after TSA pretreatment for 6 hours and repeat the above assay.Results:With the treatment of TGF-β1,the expression of E-cad protein was down regulated;α-SMA,HDAC1 and HDAC8 protein was unregulated.E-cad mRNA was down regulated;both the mRNA of α-SMA and HDAC8 were up regulated at 12 h,and were down regulated at 6 h,24 h;HDAC1 mRNA at 6 h were down regulated,24 h was up regulated.After pretreated with TSA,the expression of E-cad protein was up regulated;α-SMA,HDAC1 and HDAC8 protein was down regulated.E-cad mRNA was up regulated;α-SMA mRNA at 6 h,12 h was up regulated,24 h was down regulated;HDAC1 mRNA was down regulated;HDAC8 mRNA was up regulated.Conclusion:It is possible to use TSA inhibited RLE-6TN cells to receive α-SMA phenotype,loss of E-cad phenotype,which partially reverse the EMT of RLE-6TN induced by TGF-β1 in vitro.

HDAC1;TGF-β1;TSA;alveolar epithelial type II cells;EMT

R563.1+3

A

1672-2345（2013）03-0016-04

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81100045）

2013-10-15

姜巍，碩士研究生，主要從事外科學(xué)研究. *通信作者：徐國(guó)萍，教授.