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    蛋白激酶CK2β亞基在肝癌中上調(diào)表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

    2013-04-09 02:48:50張?jiān)?/span>
    關(guān)鍵詞:蛋白激酶激酶肝癌

    張 薇,張?jiān)?,?灝,余 龍

    (復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳學(xué)研究所,上海 200433)

    肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一,全球發(fā)病率已超過100萬/年,我國(guó)一直是世界范圍內(nèi)肝癌高發(fā)區(qū),我國(guó)的肝癌死亡率位于癌癥死亡率的第二位.發(fā)病率約為歐美國(guó)家的10倍[1].肝癌因其惡性程度高,浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移性強(qiáng),病情進(jìn)展快,以及缺乏有效的早期診斷方法,大部分患者就診時(shí)已為晚期.肝癌是先天耐藥的癌癥,細(xì)胞毒化療藥物對(duì)晚期肝癌療效差,治療技術(shù)有限,有效治療尚無標(biāo)準(zhǔn)方案[2].因此肝癌致病基因以及致病機(jī)理的研究對(duì)于肝癌的病理診斷和針對(duì)肝癌特異靶點(diǎn)的藥物研發(fā)尤為重要.

    蛋白激酶CK2最初發(fā)現(xiàn)于1954年,曾經(jīng)被稱為酪蛋白激酶Ⅱ,是一種在真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴性絲/蘇氨酸蛋白激酶,高度保守且功能多樣[3-6].在細(xì)胞的生長(zhǎng),增殖,凋亡以及生物節(jié)律的調(diào)控中均發(fā)揮重要的作用.CK2是一類酶家族,由兩類催化亞基(α和α')和一類調(diào)節(jié)亞基(β)構(gòu)成.CK2可以以全酶的形式存在,形成異源四聚體(α2β2;α'2β2;αα'β2),各個(gè)亞基也可能以游離的狀態(tài)存在[7].CK2是一種具有底物水平磷酸化能力的蛋白激酶,有多種底物,這些底物涉及細(xì)胞功能的許多方面,如DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄,RNA加工與翻譯,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與加工,癌基因與抑癌基因活性的調(diào)節(jié)等[8,9].

    目前的研究表明CK2不僅對(duì)于細(xì)胞的存活和正常的生理功能的行使必不可少,而且與眾多疾病,特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,在迄今為止已檢測(cè)過的腫瘤中,CK2均表達(dá)失調(diào).CK2激酶活性的增高可能與腫瘤細(xì)胞的分化程度及侵襲轉(zhuǎn)移等有關(guān).如Pallares等在研究發(fā)現(xiàn),在頭頸癌中CK2的激酶活性的增高與腫瘤的分級(jí)分期密切相關(guān)[10].一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí),CK2的表達(dá)失衡導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)致癌潛能被激發(fā).如CK2聯(lián)合C-Myc的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以顯著增加小鼠患淋巴瘤和白血病的幾率.這些研究表明,CK2參與腫瘤的發(fā)生可能與其對(duì)細(xì)胞中其他致癌信號(hào)的調(diào)控有關(guān)[11].因此CK2已經(jīng)成為一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn),不同作用模式的CK2抑制劑相繼誕生,根據(jù)其作用模式的不同,可以分為ATP競(jìng)爭(zhēng)性和非ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,后者又包括底物靶向抑制劑,CK2α亞基外部靶向抑制劑及阻斷亞基相互作用抑制劑[12].

    CK2的β亞基,是催化亞基α或α'的特異配體,對(duì)全酶活性及穩(wěn)定性起調(diào)節(jié)作用.其N端(5~104AA)組成的α螺旋酸性環(huán)區(qū)通過與α亞基的賴氨酸富含區(qū)相互作用,調(diào)節(jié)CK2的激酶活性,控制其對(duì)底物的磷酸化.與催化亞基具有多種異構(gòu)體不同的是,目前在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)亞基CK2β只發(fā)現(xiàn)了一種,由215個(gè)氨基酸殘基組成,在種屬間具有高度保守性(如人與果蠅之間可達(dá)88%同源性),這提示CK2β是CK2細(xì)胞功能重要介導(dǎo)劑[12,13].過去曾認(rèn)為CK2β只存在于全酶中,對(duì)催化亞基起靶向調(diào)節(jié)作用,因此以往的研究多針對(duì)CK2α催化亞基,特別是以其作為抑制CK2激酶活性并作為抗腫瘤藥物的靶點(diǎn),而往往忽視了調(diào)節(jié)亞基CK2β的功能.然而,現(xiàn)在越來越多的資料表明,CK2β?lián)碛械莫?dú)立于CK2激酶的功能,具有更為重要和廣泛的調(diào)節(jié)作用,它通過與c-Mos,Chk1,A-Raf等激酶直接互作調(diào)節(jié)其激酶活性,在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能[14-17].如Martel等人用特異性小肽靶向CK2β,可增加P53蛋白量,通過P53途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18].也有文獻(xiàn)顯示,在非小細(xì)胞肺癌中,CK2β的表達(dá)明顯上升,特異性靶向CK2β的siRNA可下調(diào)CK2β的蛋白表達(dá),提示CK2β亞基可能作為一有效的抗癌藥物篩選的分子靶點(diǎn)[19,20].此外,小鼠和秀麗隱桿線蟲CK2β缺失是致死型突變[21],說明其在細(xì)胞生存中起著舉足輕重的作用.

    報(bào)道顯示,CK2β在腫瘤中的表達(dá)變化僅在頭頸部腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌等中有報(bào)道[22-25],其在腫瘤中的功能也缺少深入的研究.本文擬研究CK2β在肝癌中的表達(dá)變化及功能,考察CK2β在肝癌中的表達(dá)變化及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響.此外,還將研究消減CK2β表達(dá)能否提高肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,對(duì)siRNA消減靶向CK2β與現(xiàn)有化療藥物聯(lián)合使用進(jìn)行了初步探討.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    91例原發(fā)性肝癌及癌旁組織cDNA樣品來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院.75例原發(fā)性肝癌與癌旁組織樣品購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司,所有診斷均經(jīng)病理切片證實(shí),染色強(qiáng)度評(píng)分由病理科醫(yī)生獨(dú)立完成.

    1.2 細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染

    采用SMMC-7721肝癌細(xì)胞均勻接種,使其16h后達(dá)40%~50%匯合度.將4μL Lipofectamin2000與100μL DMEM混合孵育,siRNA片段與100μL DMEM混合孵育,靜置15min.將已貼壁的細(xì)胞用PBS清洗一遍,更換無血清DMEM培養(yǎng)基,45min后將轉(zhuǎn)染混合物均勻滴加,使得siRNA的終濃度達(dá)到10~20nmol/L.4h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).CK2β的敲減siRNA片段序列為(上海吉瑪生物公司):SiRNA-1:sense5'-3'CGCUACAUCCUUACCAACCGU,Antisense5'-3'ACGGUUGGUAAGGAU GUAGCG;SiRNA-2:sense5'-3'CUUUGGUUACUGUCCUCUUGU,Antisense5'-3'ACACGAGGACA GUAACCAA;siRNA-Ns:sense5'-3'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT,Antisense 5'-3'ACGUGAC ACGUUCUCATAA.

    1.3 Real-time PCR

    按照TOYOBO公司SYBR Green Supermix試劑盒說明書操作.利用溫度梯度PCR摸索適合CK2β實(shí)時(shí)PCR引物的退火溫度.退火溫度60℃,35個(gè)循環(huán).4復(fù)孔,以β2-MG作為內(nèi)參基因,基因的表達(dá)量用相對(duì)定量的方法進(jìn)行比較.引物序列(上海生物工程公司)CK2β-F:GTCCTGGATTTCCTGGTTC TGTG;CK2β-R:CTGCTCAATCAGGTCACTCTGG.

    1.4 Western blot

    配置SDS-PAGE分離膠和濃縮膠,用SDS上樣緩沖液充分裂解細(xì)胞,收集裂解液,100℃水浴變性8min.室溫100V電壓下進(jìn)行電泳.卸膠,轉(zhuǎn)移緩沖液平衡凝膠和硝酸纖維素膜20min.4℃濕轉(zhuǎn)法100V 2h,脫脂牛奶室溫封閉1h.封閉緩沖液稀釋一抗,室溫下孵育2h或4℃搖床過夜.將膜浸泡在TBST洗滌緩沖液中,漂洗10min,重復(fù)3遍.封閉緩沖液中稀釋二抗(1∶5000~1∶10000),室溫下?lián)u床孵育1h,洗膜3次.用ECL法進(jìn)行顯色.抗體來源:β-actin單克隆抗體(Sigma公司);抗人CK2βmonoclonal antibody(Epitomics公司).

    1.5 免疫組化檢測(cè)CK2β在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)

    將組織芯片放入全自動(dòng)染色機(jī)中進(jìn)行脫蠟;用純水沖洗3次,1次1min.放入阻斷劑中15min;用PBS緩沖液沖洗3次;一抗放入離心機(jī)中7200r/min離心30s,按照1∶50稀釋度用DAKO抗體稀釋液稀釋;滴加一抗,放入4℃冰箱過夜孵育;室溫放置30~45min;將片子用PBS緩沖液沖洗3次;滴加DAKO公司的EnVisionTM+/HRP兔工作液,孵育30min;時(shí)間到后用PBS沖洗3次,1次1min;在片子上滴加稀釋后的DAB,顯色5min,到時(shí)后自來水沖洗5min;在片子上滴加哈氏蘇木素(Sigma公司)40s,用自來水沖洗2min;將片子放入全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行脫水,取出封片.鏡檢拍照.

    1.6 MTS法測(cè)定消減細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

    將細(xì)胞種于6孔板中,至40%~50%匯合度時(shí),按細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染.24h后,消化細(xì)胞,計(jì)數(shù)后接種于96孔板中(2×103/孔).每24h,每孔加入10μL MTS/DMEM混合液,繼續(xù)培養(yǎng)3h后顯色,連續(xù)檢測(cè)6d.以沒有任何細(xì)胞的無血清DMEM為對(duì)照.檢測(cè)前搖晃培養(yǎng)板8s,混勻.用BioTek H4酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450nm時(shí)各孔的光吸收值.

    本研究結(jié)果顯示,相對(duì)于NIPPV單用,納洛酮聯(lián)用NIPPV能顯著增加PO2水平和降低PCO2水平,增加SaO2水平,兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說明納洛酮聯(lián)用NIPPV能顯著糾正機(jī)體酸堿平衡,糾正低氧血癥;其次,住院死亡率和再次有創(chuàng)氣管插管率顯著降低,說明納洛酮能顯著降低NIPPV治療失敗率,同時(shí)顯著減少住院時(shí)間,有利于減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。用藥期間未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng),患者耐受性好,說明納洛酮聯(lián)用NIPPV安全性較好。

    1.7 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

    細(xì)胞接種和饑餓:首先在35mm的皿底端做好標(biāo)記,將細(xì)胞分為不同的區(qū)域.將目的細(xì)胞按每孔約1.5×106個(gè)細(xì)胞接種,貼壁后細(xì)胞密度約為100%的匯合度時(shí),用PBS漂洗細(xì)胞2遍,加入無血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng).

    細(xì)胞劃痕:細(xì)胞饑餓24h后,用20μL的槍頭在鋪滿細(xì)胞的皿中劃一條痕跡,然后用PBS洗2遍,洗去細(xì)胞碎片.Leica DM RA2顯微鏡鏡檢:取不同時(shí)間點(diǎn)用倒置顯微鏡拍攝細(xì)胞相同位置的遷移情況.

    2 結(jié) 果

    2.1 CK2β在肝癌組織mRNA水平顯著上調(diào)表達(dá)及其與肝癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)分析

    用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)了91對(duì)肝癌和癌旁標(biāo)本中CK2β的mRNA水平.采用△△Ct值法,試驗(yàn)中以β2-MG基因作為內(nèi)參基因,計(jì)算每對(duì)樣本中癌組織的CK2β的mRNA與β2-MG的mRNA的相對(duì)表達(dá)量之比(T/N),對(duì)相對(duì)表達(dá)量取log2值作圖(圖1).分析時(shí),顯著性差異的閾值設(shè)定為±1.分析時(shí),正一為上調(diào)一倍,負(fù)一為下調(diào)50%.在69對(duì)樣品(75.8%)中,CK2β在癌組織中呈現(xiàn)顯著性上調(diào),在8對(duì)樣本(8.79%)中差異不明顯,20對(duì)樣本(21.98%)中呈現(xiàn)顯著性下調(diào).

    圖1 CK2βmRNA水平在肝癌組織中顯著性上調(diào)Fig.1 The high expression of gene CK2βmRNA level in HCC

    為了觀察CK2β的表達(dá)變化是否對(duì)臨床診斷和治療具有指導(dǎo)性意義,我們將91對(duì)肝癌樣本中CK2β的mRNA變化數(shù)據(jù)與臨床病理特征進(jìn)行了相關(guān)性分析(表1(見第250頁(yè))).盡管在AFP(Alphafetoprotein),病理分化程度(Pathological differentiation),腫瘤包膜(Tumor encapsulation),肝硬化結(jié)節(jié)(Hepatic cirrhotic nodule),癌栓(Portal vein tumor thromb)等指標(biāo)中沒有觀察到相關(guān)性,但是發(fā)現(xiàn)CK2β的表達(dá)變化與臨床分期(TNM clinical stage)具有相關(guān)性.卡方檢驗(yàn)得出的P值為0.02.這一結(jié)果表明,CK2β的上調(diào)表達(dá)可能參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展.

    表1 CK2βmRNA水平在HCC中的表達(dá)與病理資料相關(guān)性分析Tab.1 The correlation between CK2βmRNA expression and clinical pathological data

    2.2 CK2β在肝癌組織中的分布和表達(dá)情況及其與臨床病理資料的相關(guān)性分析

    對(duì)75對(duì)肝癌組織和相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè),將CK2β的多克隆抗體以1∶50比例稀釋,檢測(cè)結(jié)果如下圖所示(圖2).隨后對(duì)75對(duì)樣本染色強(qiáng)弱進(jìn)行了分級(jí),0、+、++、+++分別代表染色強(qiáng)度弱、中等、強(qiáng)、較強(qiáng).經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析:在肝癌和癌旁組織中,CK2β在細(xì)胞核與細(xì)胞漿中均有表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度有所不同,CK2β在肝癌組織較之癌旁組織總體表達(dá)強(qiáng)度顯著增高(P<0.01)(表2).這提示我們CK2β的表達(dá)強(qiáng)度的增高與肝癌的發(fā)生發(fā)展有顯著性的關(guān)系.

    圖2 CK2β在癌及癌旁中免疫組化檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The expression of CK2βby immunefluorescent

    表2 75對(duì)肝癌及癌旁DAB染色分級(jí)統(tǒng)計(jì)分析表Tab.2 The analysis result of DAB staining of 75HCC cancer and adjacent cancer tissues

    為了觀察CK2β的表達(dá)變化是否對(duì)于臨床診斷和治療具有指導(dǎo)意義,我們將75對(duì)肝癌樣品中CK2β的免疫組化染色強(qiáng)度與臨床病例資料進(jìn)行了相關(guān)性分析(表3).對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的染色強(qiáng)度分析得出:CK2β的表達(dá)與年齡(Age),是否小肝癌(Small hepatocellular carcinoma),病理分化程度具有相關(guān)性.卡方檢驗(yàn)計(jì)算其P值分別為:0.02、0.03、0.01.其中與病理分化程度高度顯著相關(guān).對(duì)細(xì)胞漿內(nèi)的染色強(qiáng)度分析得出:CK2β的表達(dá)與是否結(jié)節(jié)(Hepatic cirrhotic nodule)病理分化程度有相關(guān)性.卡方檢驗(yàn)計(jì)算其P值分別為:0.02、0.04.結(jié)果顯示無論在胞核染色還是胞漿染色中,CK2β的表達(dá)和病理分化程度均呈現(xiàn)顯著相關(guān)性.

    表3 CK2β染色強(qiáng)度與病理資料相關(guān)性分析Tab.3 The correlation between CK2βstaining degree and clinical pathological data

    2.3 siRNA消減CK2β基因表達(dá)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)

    經(jīng)siRNA小片段轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后,48h收集蛋白裂解液樣.敲減內(nèi)源CK2β的細(xì)胞裂解樣品經(jīng)檢測(cè)后,在敲減片段作用下雜交條帶強(qiáng)度與對(duì)照組相比,蛋白表達(dá)不同程度的減弱,結(jié)果顯示該抗體能夠準(zhǔn)確識(shí)別該目的基因.因此從蛋白水平證實(shí)了敲減片段的有效性,細(xì)胞中的CK2β蛋白的表達(dá)被有效的抑制(圖3(a)).

    為了觀察CK2β基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)的影響,用經(jīng)過有效性驗(yàn)證的CK2β的siRNA小片段轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞.MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(b)顯示,經(jīng)過6天的連續(xù)檢測(cè),敲減掉內(nèi)源的CK2β后,細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減慢.與對(duì)照轉(zhuǎn)染Ns小片段的實(shí)驗(yàn)組和未轉(zhuǎn)任何片段的non實(shí)驗(yàn)組相比,細(xì)胞從第4~5天起,增殖情況出現(xiàn)顯著性差異,生長(zhǎng)減緩(P<0.01).

    克隆形成實(shí)驗(yàn)(圖3-(c)),將SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板中,貼壁后,至40%~50%匯合度時(shí),轉(zhuǎn)染CK2β敲減siRNA片段1#2#,每組均種有3復(fù)孔.Control組為未轉(zhuǎn)入任何片段組,Ns組為轉(zhuǎn)入nonsilence片段的對(duì)照組.24h后,消化細(xì)胞,并計(jì)數(shù).于6孔板中每孔種入1000個(gè)細(xì)胞.37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2周,期間每3天更換1次新鮮培養(yǎng)基.2周后結(jié)晶紫染色顯示克隆的形成情況.瞬時(shí)敲減掉CK2β基因的克隆形成的大小和密度明顯減小,克隆個(gè)數(shù)減少.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲CK2β除后能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞中克隆的形成.

    圖3 消減CK2β表達(dá)后對(duì)細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect on cell growth when downregulate the expression of CK2β

    2.4 敲減CK2β表達(dá)減弱細(xì)胞株的遷移和侵襲能力

    為研究CK2β對(duì)于細(xì)胞株遷移能力的影響,在SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA小片段24h后,消化細(xì)胞計(jì)數(shù)并種板,使細(xì)胞達(dá)到100%匯合度.細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞,24h后劃痕,分別在0,24,48,72h時(shí)顯微鏡10倍鏡下觀察同一區(qū)域并拍照.如下圖所示:NS為對(duì)照轉(zhuǎn)染non-silence片段組,I1為轉(zhuǎn)染1#敲減小片段實(shí)驗(yàn)組.結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組敲減掉CK2β,在48h后遷移的面積明顯小于對(duì)照組(圖4).細(xì)胞遷移區(qū)域有顯著性差異,細(xì)胞遷移速度減慢.

    2.5 消減CK2β表達(dá)豐度能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性

    CK2β在肝癌組織中明顯的上調(diào)表達(dá),并且能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,因此可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用.那么消減CK2β是否能夠增加肝癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性,是否可能成為某種抗腫瘤藥物或聯(lián)合用藥的潛在藥物靶點(diǎn)?

    用臨床上常用的10種抗腫瘤藥,將實(shí)驗(yàn)組分為四組:A轉(zhuǎn)染non-silence片段,不加藥;B轉(zhuǎn)染nonsilence片段,加藥;C轉(zhuǎn)染CK2β消減siRNA片段,加藥;D轉(zhuǎn)染CK2β消減siRNA小片段,不加藥組.48 h后用MTS方法檢測(cè).細(xì)胞相對(duì)存活率用后3組的數(shù)據(jù)除以對(duì)照組A組數(shù)據(jù)的平均數(shù)來計(jì)算.t-test結(jié)果顯示(圖5):相對(duì)于其他3組對(duì)照組,消減CK2β能夠增強(qiáng)SMMC-7721細(xì)胞對(duì)于喜樹堿,長(zhǎng)春新堿,阿霉素和柔紅霉素的敏感性.

    圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig.4 The cell erasion trace test result

    圖5 10種抗腫瘤藥物作用下細(xì)胞生存率效果圖Fig.5 The cell viability after the treatment of 10different anti-cancer drugs

    3 討 論

    目前對(duì)于CK2在腫瘤中的作用已有深入的研究.CK2的表達(dá)水平與活性的明顯增高,不僅與腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散能力,癌癥預(yù)后相關(guān),還反映其病理生理學(xué)特征.

    蛋白激酶CK2一直被認(rèn)為是治療腫瘤的一個(gè)具有潛力的分子靶點(diǎn),目前已知的小分子抑制劑主要包括活性肽,鹵代化合物TBB衍生物,多酚衍生物,以及以吲哚喹啉為基礎(chǔ)的衍生物.其中CK2抑制劑CX4945已進(jìn)入Ⅰ期臨床,開始面向晚期實(shí)體瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者.這些靶向CK2激酶的藥物研究主要是設(shè)計(jì)針對(duì)CK2催化亞基的小分子抑制劑[26].由于長(zhǎng)久以來研究者僅認(rèn)識(shí)到CK2β存在于全酶中對(duì)催化亞基起靶向調(diào)節(jié)作用的功能,忽視了其獨(dú)立于該復(fù)合物的功能,因而CK2β的研究一直比較粗淺,特別是缺少其在腫瘤中的功能性研究.近年來現(xiàn)在越來越多的研究開始關(guān)注CK2β獨(dú)立于CK2激酶的功能,揭示了其更為重要和廣泛的調(diào)節(jié)作用,它通過與c-Mos、Chk1、A-Raf等激酶直接互作調(diào)節(jié)其激酶活性,在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能[7-10].

    對(duì)于CK2β在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸引起研究者的重視.在血液系統(tǒng)腫瘤中:具有正常核型的急性髓細(xì)胞樣白血病患者中,CK2抑制劑的敏感性與CK2β基因的表達(dá)水平密切負(fù)相關(guān);慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的存活方面,抑制CK2β基因表達(dá)影響白血病細(xì)胞的存活率.在實(shí)體腫瘤中:Laramas等人的研究顯示,男性前列腺癌中,針對(duì)CK2β的小干擾RNA能夠特異性抑制前列腺細(xì)胞而對(duì)良性細(xì)胞沒有作用.女性子宮內(nèi)膜癌中CK2β的表達(dá)率和強(qiáng)度都明顯升高,利用短發(fā)夾RNA(shRNA)下調(diào)CK2β,癌細(xì)胞的集落形成受阻.在宮頸癌,乳腺癌,頭頸癌,神經(jīng)膠質(zhì)瘤,胃癌,非小細(xì)胞肺癌,結(jié)直腸癌中通過抑制CK2β的表達(dá),都不同程度抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[27,28],發(fā)揮重要功能.

    CK2β在肝癌中的表達(dá)變化和功能研究尚屬空白.本研究首先91對(duì)肝癌樣本的CK2β的mRNA水平進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)CK2β較癌旁組織顯著性上調(diào)表達(dá).對(duì)75對(duì)組織標(biāo)本的免疫組化檢測(cè)結(jié)果同樣顯示,較癌旁組織,CK2β蛋白水平表達(dá)明顯上升,分析顯示有顯著性差異(P<0.01),胞漿和胞核中均顯著性上調(diào)表達(dá).這提示:CK2β可能在肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中行使一定的功能.

    隨后合成了針對(duì)CK2β的敲減小片段,從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證了其具有明顯的消減效果.瞬時(shí)消減SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)源的CK2β蛋白,經(jīng)過MTS檢測(cè),細(xì)胞的生長(zhǎng)速率顯著性減慢.克隆形成的實(shí)驗(yàn)也相互佐證了該結(jié)果,在敲減掉CK2β的細(xì)胞株中,克隆形成的大小和個(gè)數(shù)有顯著性差異,細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成減慢.在劃痕實(shí)驗(yàn)中,瞬時(shí)消減SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)源的CK2β蛋白表達(dá),48h及72h后開始可以觀察到顯著性差異,細(xì)胞遷移的速度減慢.這些都提示:CK2β與肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力有關(guān).這些結(jié)果表明,CK2β在肝癌中顯著上調(diào)表達(dá),其表達(dá)量與臨床分期呈正相關(guān),提示其可能作為輔助肝癌診斷的分子marker.瞬時(shí)消減細(xì)胞內(nèi)源的CK2β表達(dá)可以有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移,提示CK2β是肝癌細(xì)胞快速增殖和遷移所必需的.將進(jìn)一步在裸鼠成瘤動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證其在體內(nèi)對(duì)瘤體生長(zhǎng)的影響.

    本研究還就CK2β在肝癌中能否影響抗腫瘤藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的敏感性做了初步的探討.發(fā)現(xiàn)CK2β的下調(diào)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素,柔紅霉素,喜樹堿,長(zhǎng)春新堿的敏感性.因喜樹堿等藥物通過參與DNA的損傷來發(fā)揮抑制腫瘤作用,而CK2β亦影響DNA的損傷與修復(fù).因此猜測(cè)可能發(fā)揮協(xié)同的效應(yīng).但分子機(jī)制有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明.長(zhǎng)期以來,由于肝癌的治療沒有很有效的治療藥物,采用手術(shù)的切除率還不到15%,抗肝癌治療至今處于技術(shù)有限,有效藥物很少的困難境地.諾拉曲特(Nolatrexed)是目前唯一針對(duì)肝癌的處于三期臨床研究階段的化合物.因此開發(fā)有效的化療藥物應(yīng)用于肝癌的治療非常必要.由于傳統(tǒng)的化療藥物如阿霉素,5-FU反應(yīng)率低,選擇性差,毒副作用較大,而用紫杉醇,氟達(dá)拉賓等藥物進(jìn)行全身化療時(shí)的反應(yīng)率幾乎為零[1].因此尋找肝癌特異性的治療靶點(diǎn)成為當(dāng)前肝癌化療藥物開發(fā)的熱點(diǎn)和難點(diǎn).本研究不僅提示了CK2β作為新的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的可能,并且為通過聯(lián)合用藥提高現(xiàn)有抗腫瘤藥物藥效的腫瘤治療思路提供了新的線索.

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