野生型及突變型HIV－1LTR驅動的熒光素酶穩(wěn)定表達細胞株的建立

劉 林，楊少宗，林師冠，王曉輝，孔垂瑾，曲喜英，朱煥章

（1.復旦大學 生命科學學院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200433；（2.河南 洛陽職業(yè)技術學院，洛陽 471001）

獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immuno Deficiency Syndrome，AIDS）病人體內HIV－1潛伏感染細胞的存在，是造成病人在高效抗逆轉錄病毒療法（Highly Active Antiretroviral Therapy，HAART）治療中止后外周血中病毒拷貝數重新反彈的主要原因［1，2］.在這個病毒儲藏庫中，HIV－1整合在宿主細胞基因組中但病毒基因并不表達，使得該細胞與正常細胞并無區(qū)別從而逃避免疫系統(tǒng)的清除作用［3］.當這些潛伏細胞受到細胞因子等刺激而活化后，病毒基因就能得以激活并產生新的病毒，從而使血液中病毒拷貝數反彈［4］.

目前一種新型的“激活 清除”治療策略，就試圖通過特定的激活劑來激活潛伏病毒，并輔以HAART 治療來阻止新產生病毒的傳播，最終利用免疫系統(tǒng)的作用來清除潛伏感染細胞［5，6］.由于在感染HIV－1的病人體內，每106個靜止CD4＋T細胞中才有一個整合有復制完全型的HIV－1，這意味著一個病人體內的潛伏感染的細胞數不會超過107［7］.因此，建立有效的用于藥物篩選的模型，是成功篩選高效、低毒性HIV潛伏激活劑的一個關鍵.

HIV－1基因表達極其依賴于宿主細胞內的轉錄因子［8］.造成HIV－1潛伏感染的一個重要分子機制就是轉錄激活相關轉錄因子的缺乏［9］.在HIV－1潛伏感染的建立和再激活中，NF－κB和Tat扮演了至關重要的角色［4，8］.靜止記憶CD4＋T淋巴細胞核中缺乏活化的NF－κB，是這些淋巴細胞中促使HIV－1原病毒潛伏的關鍵因素［10］.Tat蛋白是HIV－1基因正常轉錄所必需的，缺少了Tat的作用會導致病毒基因不能夠正常轉錄表達而促使病毒在宿主細胞內潛伏［8］.在這過程中，NF－κB和Tat通過分別結合到HIV－1 LTR中κB和TAR元件上發(fā)揮作用.因此，本文旨在構建野生型及κB或TAR元件突變型HIV－1LTR驅動的熒光素酶表達載體，并將其轉染人腎表皮細胞293，通過G418篩選以獲得熒光素酶穩(wěn)定表達細胞克隆.由于TNF－α是一種有效的激活HIV－1表達的激活劑，它能夠特異性激活下游NF－κB信號通路［9］，可以用來研究這些細胞模型對于TNF－α的反應是否符合預期.我們進一步用激活劑TNF－α對該體外系統(tǒng)進行處理，以初步探討模型在篩選HIV－1潛伏激活藥物及信號通路機制研究方面的作用.

1 材料與方法

1.1 材料

pHIV LTR－Luc、pHIV LTRΔκB－Luc和pHIV LTRΔTAR－Luc由Warner C.Greene實驗室提供.

大腸桿菌DH5α、pcDNA3.0質粒均為本實驗室保存；各種限制性內切酶，以及T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司.PCR引物、DNA序列測定均由上海英駿生物技術有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1 質粒構建

以pHIV LTR－Luc報告質粒為模板，用Primer Premier 5軟件進行引物設計，PCR擴增HIV LTRLuc片段.引物由上海英駿公司合成，序列如下：LTRNdeI－5'－GGTACATATGTGGAAGGGCTAATT TGGTC－3'和LUCXhoI－5'－AATACTCGAGATTCGTTAAAATAGTACAGTGACCC－3'.PCR反應按以下參數進行：94℃3min；（94℃30s，56℃30s，72℃150s）×32；70℃10min.膠回收PCR產物，用NdeⅠ和XhoⅠ分別酶切PCR擴增產物和pcDNA3.0載體.回收DNA片段，并用T4DNA連接酶16℃連接過夜.連接產物用氯化鈣法轉化大腸桿菌DH5α，在氨芐青霉素（終濃度50μg／mL）的LB平板中培養(yǎng)過夜后，挑選菌落抽提質粒進行酶切和測序鑒定.

1.2.2 轉染及穩(wěn)定細胞株的篩選

24孔板中每孔接種5×105個293細胞，待培養(yǎng)板中細胞覆蓋率在95%以上，用Lipofectamin 2000轉染試劑按照2μL∶0.8μg比例轉染pcDNA3.0－HIV LTR－Luc及其突變型質粒.細胞在含800μg／mL新霉素（G418）培養(yǎng)液培養(yǎng)14d后，將細胞消化后按梯度稀釋種在96孔板中.待能夠看到明顯克隆后，尋找單個細胞克隆用胰酶消化擴大培養(yǎng)，并提取基因組DNA進行PCR擴增鑒定.

1.2.3 熒光素酶活性檢測

穩(wěn)定細胞克隆在高糖的DMEM（Gibco產品）細胞培養(yǎng)液中（含10%胎牛血清，100U／mL青霉素，100g／mL鏈霉素），37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當24孔細胞培養(yǎng)板中細胞覆蓋率達到95%以上，加入終濃度為10ng／mL TNF－α［11］或10μmol／L PMA（Phorbol－12－myristate－13－acetate，PMA）的培養(yǎng)液培養(yǎng).培養(yǎng)18h讓藥物充分作用后，棄去上清，用PBS清洗細胞.然后按照熒光素酶檢測試劑盒（Dual Luciferase Assay System，Promega）說明書步驟操作：棄去培養(yǎng)基，用500μL 1×PBS清洗細胞；將PBS完全棄去后，每孔加入100μL的細胞裂解液，在搖床上裂解15min.將上述裂解細胞及上清收集到1.5mL的EP管內，12000r／min離心1min.保留上清進行后續(xù)檢測.樣品放冰上，用冷光儀（Lumat LB 9507）檢測細胞內熒光素酶的表達水平.同時設立不加藥組、加藥組和沒有轉染質粒的人胚胎腎細胞293細胞作為空白組.儀器參數設置見Lumat LB 9507操作手冊.加藥組與未加藥組熒光素酶檢測值的比值可以用來表示藥物對于該體外系統(tǒng)中細胞中LTR的激活效果.每個實驗重復3次以獲得平均值.

2 結 果

2.1 HIV－1LTR驅動的熒光素酶表達質粒的構建和穩(wěn)定細胞株的篩選

以pHIV LTR－Luc為模板進行PCR，擴增出HIV LTR－Luc片段.然后通過Nde I和XhoI酶切，連接到pcDNA3.0質粒的相應位置，獲得pcDNA3.0－HIV LTR－Luc表達質粒.LTR上κB和TAR元件突變的突變型質粒構建方法也與之類似，區(qū)別之處在于PCR的模板分別為pHIV LTRΔκB－Luc和pHIV LTRΔTAR－Luc.

將質粒分別轉染293細胞，經G418篩選獲得穩(wěn)定細胞株293－HIV LTR－Luc、293－HIV LTRΔκB－Luc和293－HIV LTRΔTAR－Luc.然后，分別提取基因組DNA進行PCR擴增鑒定，擴增結果瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.如圖1所示，PCR得到略小于2500bp的特異性條帶，與預期2300bp片段大小相符.PCR擴增片段回收送樣測序，測序結果用MegaAlign軟件進行比對.比對結果顯示，293－HIV LTRΔκB－Luc中LTR上350nt位置的2個κB串聯(lián)序列被缺失突變，而293－HIV LTRΔTAR－Luc則在490nt附近有4bp的缺失（見圖1中下劃線標注位置）.這些突變位點與野生型LTR中順式元件所在位置相符.

圖1 細胞株基因組DNA的PCR檢測及序列比對結果Fig.1 The results of DNA PCR and sequence alignment

2.2 TNF－α對HIV－1LTR驅動的熒光素酶穩(wěn)定表達細胞模型的激活效果

為了驗證這些細胞模型能夠通過熒光素酶表達反映HIV－1LTR的活性，我們采用10ng／mL的TNF－α［11］對這些細胞模型進行處理冷光儀可以檢測熒光素酶表達水平，來反映TNF－α對于不同細胞模型的激活效果我們發(fā)現(xiàn)，對于野生型LTR的細胞模型來說，10ng／mL的TNF－α激活18h后熒光素酶表達水平是激活前的2.87±0.09倍（與對照相比，P＝0.017），PMA處理為激活前的1.7±0.11倍；而同樣條件下，缺失了κB位點的細胞株無明顯激活效果（TNF－α為0.96±0.07倍，PMA為1.00±0.13，P＞0.05，見圖2）對于TAR位點突變的細胞株，TNF－α對熒光素酶表達水平的激活效果與野生型LTR細胞株相比較弱（1.51±0.01倍，P＜0.05），PMA處理為1.3±0.12倍.

2.3 TNF－α對于同一細胞模型中不同細胞克隆的激活結果

圖2 TNF－α及PMA對野生型及突變型LTR細胞模型的激活效果Fig.2 The effects of TNF－αand PMA in wild－type and mutant LTR cell model

為了研究同一細胞模型中不同細胞克隆之間LTR對于熒光素酶的調控是否有較大區(qū)別，我們分別對該體外系統(tǒng)中每個模型選擇了3個不同的細胞克隆，同樣用10ng／mL TNF－α處理18h.結果顯示TNF－α對同一細胞模型不同細胞克隆的熒光素酶表達水平的激活有一定的差異，但是這種差異并沒有統(tǒng)計學上的意義（P＞0.05，見圖3）.

圖3 TNF－α對同一細胞模型中不同細胞克隆的激活效果Fig.3 The effects of TNF－αin different cell clone of the same model

3 討 論

HIV－1潛伏感染是造成抗病毒療法無法根除病人體內病毒的主要原因.因此，如何清除HIV－1潛伏感染細胞是目前艾滋病治療的一個熱門方向［5］.而由于病人體內潛伏感染細胞極其稀少，每個病人體內最多也只有107個潛伏感染細胞［7］，這迫切需要我們建立一個有效的藥物篩選模型來輔助藥物篩選和進行機制研究.

HIV－1LTR作為病毒基因轉錄重要的調控區(qū)，上面包含許多與轉錄調控因子結合的順式元件［12］.這些順式元件與相應的轉錄因子信號相互作用形成了一個復雜的調控網絡.在HIV－1潛伏感染的建立和維持過程中，NF－κB和Tat參與了至關重要的角色［4，8］.NF－κB一般情況下位于細胞質中，與其抑制因子I－κB結合；在細胞信號傳導進來時，NF－κB進入細胞核結合到HIV－1LTR上的兩個串聯(lián)的κB增強子序列［13］.繼而通過直接募集組蛋白乙酰轉移酶（HATs）到HIV－1LTR上，觸發(fā)原病毒的激活［14］.Tat是由病毒基因組編碼的一種轉錄調控蛋白.研究表明，HIV－1轉錄的時候，TAR先轉錄形成一小段有著莖環(huán)結構的RNA.Tat可以結合到由TAR轉錄形成的RNA，募集轉錄復合體的一些重要組分，從而保證HIV－1轉錄延伸的順利進行［15］.在缺失Tat的條件下，轉錄起始正常但是只產生一小段無效的轉錄本.Tat表達水平作為轉錄活化和潛伏的開關［16］，當Tat在其他啟動子驅動下反式表達時，HIV－1原病毒持續(xù)性活化并且不能進入潛伏［16］.

突變型HIV－1LTR可以幫助我們有效地進行藥物篩選和信號通路機制研究.Yang等就用缺失κB位點的NL4－3LTR驅動的LUC報告質粒建立瞬時轉染細胞模型，篩選到細胞內轉錄因子Ets的一個突變型ΔVII－Ets－1能夠有效地激活靜止CD4＋T細胞中的HIV－1表達［17］.Williams等也通過ΔκB LTR的LUC報告質粒，來研究Prostratin激活潛伏HIV－1表達的信號通路［10］.與這些瞬時轉染系統(tǒng)相比，我們建立的穩(wěn)定表達系統(tǒng)具備許多優(yōu)點.由于瞬時轉染細胞中質粒DNA沒有整合進基因組DNA中，會在細胞分裂的過程中被逐漸稀釋.這使得瞬時模型不能傳代，每次實驗前都需重新轉染；而所用轉染試劑的不同，所轉染的質粒DNA的量，以及細胞狀態(tài)都會影響后續(xù)實驗結果.而在穩(wěn)定表達細胞株中，質粒DNA整合進基因組，隨著基因組進行復制，因此可以傳代使用，也避免了不同實驗者以及不同批次轉染實驗中所產生的誤差，結果重復性高.為了驗證模型的有效性，我們用TNF－α對細胞模型進行激活，對比不同細胞模型和同一細胞模型中不同細胞克隆中熒光素酶報告基因的表達水平，能夠很好地說明我們建立的這套體外系統(tǒng)能夠很好地反映不同藥物對于HIV－1LTR的激活效果.

由于我們構建的細胞模型與用野生型病毒［18，19］或者慢病毒［20］感染T淋巴細胞后篩選出來的潛伏感染細胞有所不同，細胞中整合的病毒基因組并非處于潛伏感染狀態(tài).因此，進一步證明所篩選出來的藥物能夠激活潛伏感染病毒，還需在專門的潛伏感染細胞中進行驗證.此外，我們構建的模型中HIV－1LTR上與潛伏感染相關的轉錄調控順式元件得到了突變，能夠進一步用來篩選通過特定信號通路來激活HIV－1表達的藥物.我們期望這套體外系統(tǒng)能夠為HIV－1激活劑的篩選工作提供便利.

［1］Davey R T，Bhat N，Yoder C，et al.HIV－1and T cell dynamics after interruption of highly active antiretroviral therapy（HAART）in patients with a history of sustained viral suppression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（26）：15109－15114.

［2］Persaud D，Zhou Y，Siliciano J M，et al.Latency in human immunodeficiency virus type 1infection：No easy answers［J］.Journal of Virology，2003，77（3）：1659－1665.

［3］Han Y F，Wind－Rotolo M，Yang H C，et al.Experimental approaches to the study of HIV－1latency［J］.Nature Reviews Microbiology，2007，5：95－106.

［4］Williams S A，Greene W C.Regulation of HIV－1latency by T－cell activation［J］.Cytokine，2007，39（1）：63－74.

［5］Richman D D，Margolis D M，Delaney M，et al.The challenge of finding a cure for HIV infection［J］.Science，2009，323（5919）：1304－1307.

［6］Colin L，Van Lint C.Molecular control of HIV－1postintegration latency：implications for the development of new therapeutic strategies［J］.Retrovirology，2009，6：111.

［7］Chun T W，Carruth L，F(xiàn)inzi D，et al.Quantification of latent tissue reservoirs and total body viral load in HIV－1Infection［J］.Nature，1997，387（6629）：183－188.

［8］Coiras M，Lopez－Huertas M R，Perez－Olmeda M，et al.Understanding HIV－1latency provides clues for the eradication of long－term reservoirs［J］.Nature Reviews Microbiology，2009，7（11）：798－812.

［9］Quivy V，De Walque S，Van Lint C.Chromatin－associated regulation of HIV－1transcription：implications for the development of therapeutic strategies［J］.Subcell Biochem，2007，41：371－96.

［10］Williams S A，Chen L F，Kwon H，et al.Prostratin antagonizes HIV latency by activating NF－kappaB［J］.J Biol Chem，2004，279（40）：42008－17.

［11］Quivy V，Adam E，Collette Y，et al.Synergistic activation of human immunodeficiency virus type 1 promoter activity by NF－kappa B and inhibitors of deacetylases：potential perspectives for the development of therapeutic strategies［J］.Journal of Virology，2002，76（21）：11091－11103.

［12］Pereira L A，Bentley K，Peeters A，et al.A compilation of cellular transcription factor interactions with the HIV－1LTR promoter［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（3）：663－8.

［13］Nabel G，Baltimore D.An inducible transcription factor activates expression of human immunodeficiency virus in T cells［J］.Nature，1987，326（6114）：711－3.

［14］Lusic M，Marcello A，Cereseto A，et al.Regulation of HIV－1gene expression by histone acetylation and factor recruitment at the LTR promoter［J］.EMBO J，2003，22（24）：6550－61.

［15］Karn J.The molecular biology of HIV latency：breaking and restoring the Tat－dependent transcriptional circuit［J］.Curr Opin HIV AIDS，2011，6（1）：4－11.

［16］Pearson R，Kim Y K，Hokello J，et al.Epigenetic silencing of human immunodeficiency virus（HIV）transcription by formation of restrictive chromatin structures at the viral long terminal repeat drives the progressive entry of HIV into latency［J］.J Virol，2008，82（24）：12291－303.

［17］Yang H C，Shen L，Siliciano R F，et al.Isolation of a cellular factor that can reactivate latent HIV－1 without T cell activation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（15）：6321－6326.

［18］Folks T M，Clouse K A，Justement J，et al.Tumor necrosis factor－alpha induces expression of human immunodeficiency virus in a chronically infected T－cell clone［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86（7）：2365－2368.

［19］Folks T M，Justement J，Kinter A，et al.Cytokine－induced expression of HIV－1in a chronically infected promonocyte cell－line［J］.Science，1987，238（4828）：800－802.

［20］Jordan A，Bisgrove D，Verdin E.HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro［J］.EMBO Journal，2003，22（8）：1868－1877.