食品中有機(jī)磷農(nóng)殘前處理及檢測分析技術(shù)

汪莉，陸利霞，熊曉輝，李壹

（南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京210009）

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥的使用可以有助于防治病蟲害和增加農(nóng)作物產(chǎn)量。特別是有機(jī)磷農(nóng)藥因為它們的高藥效性、光譜性、半衰期短等優(yōu)點在過去的幾十年里被大量使用[1]。但是不合理應(yīng)用卻對環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染和破壞，還會對人類的健康產(chǎn)生不利影響[2-4]。由于食品生產(chǎn)在生產(chǎn)，儲存，運(yùn)輸及銷售等各個環(huán)節(jié)，都有可能受到污染，因此安全檢測方法需體現(xiàn)快速。食品生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)，質(zhì)控人員，質(zhì)檢人員，進(jìn)出口商檢，政府管理部門都希望能夠得到準(zhǔn)確而又及時的監(jiān)控結(jié)果。所以，發(fā)展快速、可靠、安全、靈敏和實用的農(nóng)藥殘留前處理技術(shù)和檢測技術(shù)，是食品安全的一項重要研究內(nèi)容。常用的食品農(nóng)藥殘留理化分析方法主要有液相和氣相色譜法，此外還有免疫分析法、生物傳感器法和酶抑制法等。

1 常用的前處理技術(shù)

1.1 超臨界流體萃取法（SFE）

超臨界流體萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）是用超臨界液體作為萃取劑，從組分復(fù)雜的樣品中把所需的組分分離提取出來的方法，其最大優(yōu)點是將萃取分離（精制）和去除溶劑等多個單元過程合為一體，大大簡化了工藝流程，提高了生產(chǎn)效率。目前，SFE 技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[5]。

1.2 加速溶劑萃?。ˋSE）

加速溶劑萃?。ˋccelerated Solvent Extraction，ASE）是一種在升高溫度（50 ℃～200 ℃）和壓力（1 013 MPa～2 016 MPa）條件下，用有機(jī)溶劑萃取的自動化方法。因其操作簡單、基體影響小、回收率高等特點，適用于多種樣品中多種農(nóng)藥的提取。Wu 等開發(fā)了一種新的分析方法，在動物源性食品中檢測109 種農(nóng)藥殘留[6]。采用加速溶劑萃取的方法有效提取脂肪樣品中的農(nóng)藥，凝膠滲透色譜（GPC）進(jìn)行凈化，大多數(shù)農(nóng)藥的平均回收率是62.6%～107.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20.5%。

1.3 QuEChERS 法

QuEChERS 法因其具有快速、簡單、便宜、有效、可靠和安全等特點而得名[7-8]。該方法包括基于分配機(jī)理的樣品提取和加入吸附劑的分散固相萃取兩個步驟，穩(wěn)定性好、精密度高、價格低廉且不使用含氯有機(jī)溶劑。Regina 等將此法用于甘蔗汁中的7 種農(nóng)藥殘留量的測定[9]。用乙腈快速提取、無水醋酸鈉和無水硫酸鎂鹽析后，經(jīng)SPE 柱固相萃取凈化，氣相色譜電子捕獲檢測器檢測。該方法加標(biāo)回收率在62.9%～107.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1%～18%之間，檢出限為0.003 mg/L～0.04 mg/L。

1.4 固相萃取（SPE）

固相萃?。⊿olid Phase extraction，SPE）是在環(huán)境分析中使用最廣泛的的樣品制備技術(shù)。SPE 的基本原理是用吸附劑吸附水相中的分析物，然后再用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑洗脫分析物，用GC 或HPLC 進(jìn)行分析[10]。Tian 制定了一種氯霉素、恩諾沙星和29 種農(nóng)藥殘留量的測定方法[11]。用丙酮超聲提取牛奶中的有機(jī)物后，經(jīng)過C18-SPE 柱凈化，以混合溶劑甲醇和水洗脫，采用HPLC-MS/MS 測定。該方法具有良好的線性關(guān)系，在研究的濃度范圍內(nèi)的所有測試化合物相關(guān)系數(shù)均大于0.991 0。

現(xiàn)今為了改善極性化合物的固相萃取的效率，許多新的親水性吸附劑和改性吸附劑，通過引入極性基團(tuán)已經(jīng)研制出來。碳納米管（CNTs）因為其具有高吸附能力，良好的熱穩(wěn)定性和較寬的pH 等優(yōu)點，已經(jīng)作為一種新型的固相萃取和固相微萃取吸附劑被廣泛運(yùn)用[12]。Katsumata 等將多壁碳納米管做成多壁碳納米管盤（MWCNTs disc），用丙酮溶液進(jìn)行洗脫，分離和富集有機(jī)磷殺蟲劑二嗪農(nóng)以及農(nóng)藥莠去津和西瑪津，用GC/MS 分離檢測[13]。該方法的線性范圍為0.1 ng/mL～1 ng/mL，檢出限為2.5 pg/mL～5 pg/mL，RSD 為3.0%～6.9%。

1.5 固相微萃取技術(shù)（SPME）

固相微萃?。⊿olid-Phase Microextraction，SPME）是一種無（少）溶劑樣品前處理新技術(shù)，它是用表面涂漬高分子層的石英纖維頭對樣品溶液中有機(jī)分子進(jìn)行提取，然后直接進(jìn)行GC、HPLC 等分析[14]。此方法需要很少的有機(jī)溶劑，因此不會產(chǎn)生有毒的殘留物，集樣品采集、萃取、濃縮、進(jìn)樣、解析為一體。Armindo 等采用固相微萃?。⊿PME）/高效液相色譜（HPLC）/二極管陣列檢測器（DAD）技術(shù)對生菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行提取測定[15]。實驗中選用了四種不同的固相微萃取涂層：聚二甲基硅氧烷萃取性能（PDMS），聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB），聚乙二醇/模板樹脂（CW/TPR）和聚丙烯酸酯（PA），通過優(yōu)化三個變量（pH，氯化鈉和提取時間），證明CW/TPR 達(dá)到最大的吸附效果。

1.6 液相微萃取技術(shù)（LPME）

液相微萃取技術(shù)（Liquid-phase microextraction，LPME）是近年來新興的一種微型化樣品前處理技術(shù)。它主要是根據(jù)液-液萃取的原理，用微量（一般只需幾微升或十幾微升）的有機(jī)溶劑對目標(biāo)化合物實行萃取、凈化、濃縮于一體目的。Sun 等用中空纖維液相微萃取技術(shù)（HF-LPME）對魚肉組織中的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測[16]。實驗中通過丙酮試劑對魚樣品進(jìn)行提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用水-甲醇（95 ∶5，體積比）溶解，再用聚偏二氟乙烯（PVDF）中空纖維進(jìn)行萃取，檢出限的范圍在2.1 ng/g～4.5ng/g。此方法不僅降低了分析成本，也縮短了分析時間。

1.7 分子印跡技術(shù)（MIT）

分子印跡技術(shù)（Molecularimprintingtechnique，MIT）是指制備對某一特定目標(biāo)分子（模板分子、印跡分子或烙印分子）具有選擇性的聚合物，然后用特定的溶劑將模板分子洗脫的技術(shù)。ZHAO 等以殼聚糖作為基體聚合物、對硫磷為模板分子、硅酸四乙酯為交聯(lián)劑制備了對硫磷分子印跡膜，將其固定于玻碳電極表面，通過檢測示差脈沖伏安信號，實現(xiàn)了對有機(jī)農(nóng)藥對硫磷的選擇性測定[17]。在優(yōu)化的實驗條件下，峰電流與對硫磷濃度在1 μg/L～10 μg/L 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測限可達(dá)24 ng/L。

2 常用的檢測技術(shù)

2.1 色譜法

常用的儀器分析主要是色譜分析法，它是目前物質(zhì)分離分析的重要手段。根據(jù)分析物質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)的不同達(dá)到分離目的并將分析物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)換成易被測量的電信號電壓電流等，然后送到記錄儀記錄下來的方法。目前在環(huán)境、生化藥物、農(nóng)藥、精細(xì)化工產(chǎn)品分析等領(lǐng)域的應(yīng)用日益普遍。應(yīng)用于檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的色譜方法主要有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC），色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/LC-MS），毛細(xì)管電泳法（CE）等，這些方法常常與以上農(nóng)藥前處理方法一起使用，能夠進(jìn)一步改進(jìn)檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度，同時也提高了對于復(fù)雜組分的定性、定量測定的能力。

2.2 免疫分析方法（IA）

免疫分析方法是以抗原、抗體的特異性識別和可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法。近年來備受重視，是研究和應(yīng)用較多的技術(shù)，適用于食品中農(nóng)藥殘留檢測的初篩，具有常規(guī)理化分析技術(shù)無可比擬的選擇性和很高的靈敏度。根據(jù)檢測形式的不同，免疫分析方法分為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），流動注射免疫分析法（FIA），化學(xué)發(fā)光酶免疫測定（CIEIA），熒光免疫分析（IFA）等。

目前應(yīng)用于有機(jī)磷檢測的主要是酶聯(lián)免疫吸附測定法，它是將抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來的一種綜合性技術(shù)，并且在現(xiàn)場篩選和大量樣本的快速監(jiān)測中顯示出獨特的優(yōu)勢。Xu Z.L 等對O，O-二乙基類有機(jī)磷農(nóng)藥特有的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，合成了三種半抗原，并且制備出高特異性單克隆抗體，同時通過2D-QSAR 和3D-QSAR 進(jìn)行了提高檢測靈敏度及抗體識別能力的探討[18]。韋倩妮等采用活潑酯法將三唑磷半抗原（TZPM-Hap）與牛血清蛋白（BSA）和卵血清蛋白（OVA）偶聯(lián)，制備出免疫抗原（TZPM-A-BSA）和包被抗原（TZPM-A-OVA），并通過動物免疫試驗，得到1 株產(chǎn)三唑磷單克隆抗體陽性細(xì)胞株（FC3），其抗體亞類為IgM[19]。該法IC50=9.7 μg/L，最低檢測限（LOD）為1.0 μg/L，定量檢測線性范圍（IC20-IC80）為2.5 μg/L～100.0 μg/L。

2.3 生物傳感器（Biosensor）

生物傳感器技術(shù)由于其具有成本低，操作方便，響應(yīng)速度快，靈敏度高等優(yōu)點引起了人們的廣泛關(guān)注[20-21]。測定有機(jī)磷農(nóng)藥的生物傳感器大多數(shù)是基于有機(jī)磷對膽堿酯酶活性的抑制作用而設(shè)計，通常是以膽堿酯酶為分子識別元件，再加上簡單的探測器組成。近年來，各種納米材料已被廣泛采用，用來提高電極的性能，如ZrO2納米粒子的電極，多壁納米管電極，普魯士藍(lán)修飾玻碳電極等。Shang Z J 等以多壁碳納米管（MWNTs-COOH）固定乙酰膽堿酯酶，然后將其與銀基汞膜電極藕合制得乙酰膽堿酯酶生物傳感器，并用氣相色譜測定蘿卜中的辛硫磷和毒死蜱，最低檢測線分別為9.0 ×10-5mg/L 和1.0×10-4mg/L[22]。Yong D 等建立了一種檢測農(nóng)藥的電化學(xué)生物傳感器，此法主要采用大腸埃希氏菌（大腸桿菌）作為測試模型的微生物，3，5-二氯苯酚（DCP）為參考毒物，通過毒性實驗測量有毒物質(zhì)對微生物的代謝活動作用[23]。對莠滅凈，苯線磷和硫丹三種農(nóng)藥進(jìn)行檢測，其IC50值分別為6.5、22、5.7 mg/L。此結(jié)果證明，目前采用電化學(xué)生物傳感器法是一種靈敏、快速和廉價的農(nóng)藥毒性檢測方法。

2.4 酶抑制法（EIM）

酶分析法主要是利用有機(jī)磷對膽堿酯酶或植物酯酶活性的抑制作用來判斷出樣品中是否含有有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥，常見方法有：試紙法、比色法，固相酶速測法、熒光法等。這些方法總體靈敏度高、操作簡便成本較低、結(jié)果可靠，適合現(xiàn)場檢測、大批樣品篩選檢測。

目前市場上常用酶源主要分為乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinseterase，BChE）和植物酯酶。利用它們被OPs 特異性抑制的原理，可以作為生物標(biāo)志物用于農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境、軍事等領(lǐng)域中有機(jī)磷化合物的檢測。Ding 等從來源豐富的羅非魚頭部提取乙酰膽堿酯酶粗酶液，通過Triton-100 溶液進(jìn)行提取，經(jīng)過硫酸銨分級沉淀，Sephadex G-100 和DEAE 纖維素柱分離純化后，使得粗酶液活力達(dá)到20.628 U/mg[24]。從水體生物中篩選和純化AChE，對于提高酶的檢測靈敏度以及酶在水環(huán)境中的適應(yīng)性具有重要的意義。朱鴻等采用丙酮脫脂、酸沉淀、硫酸銨分級沉淀、陰離子交換和凝膠層析方法，分離純化得到鴨肝丁酰膽堿酯酶，酶活回收率為23.60%，比活達(dá)17.21 U/mg。純化后的酯酶可以成為有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的重要作用靶標(biāo)[25]。王亞飛等利用酶抑制原理，對不同來源的植物酯酶進(jìn)行篩選，以總酯酶活力、比活力及對有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏度為篩選指標(biāo)，最終確定選擇苜蓿作為有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留快速檢測用植物酯酶的適宜酶源[26]。

3 展望

隨著人們對食品安全和環(huán)境保護(hù)的日益重視，食品安全快速檢測技術(shù)的應(yīng)用價值日顯突出。由于有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留量水平很低，所以為了保證高度的準(zhǔn)確性，大部分的檢測技術(shù)都需要與一些精密的分析儀器聯(lián)用，價格極其昂貴，操作復(fù)雜，不適合現(xiàn)場的快速檢測；而目前存在的一些快檢方法仍然不夠成熟，有其一定的局限性，因此發(fā)展快速、安全、環(huán)保、準(zhǔn)確度高的檢測技術(shù)必定成為所有研究人員所致力的方向。

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