杜仲葉多酚體內(nèi)和體外抗氧化活性

劉迪，尚華，宋曉宇

（1.陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工與紡織學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 721000；2.陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司乾縣分公司，陜西乾縣 713300）

杜仲葉多酚體內(nèi)和體外抗氧化活性

劉迪1，尚華1，宋曉宇2

（1.陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工與紡織學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 721000；2.陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司乾縣分公司，陜西乾縣 713300）

摘 要：為了評(píng)價(jià)杜仲葉多酚體內(nèi)和體外抗氧化活性，杜仲葉經(jīng)大孔吸附樹脂分離、有機(jī)溶劑萃取后，得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物兩種多酚純化產(chǎn)物，測(cè)定各產(chǎn)物中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并采用動(dòng)物試驗(yàn)考察各純化產(chǎn)物對(duì)小鼠丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的影響，以評(píng)價(jià)不同多酚產(chǎn)物的體內(nèi)抗氧化活性，同時(shí)測(cè)定各產(chǎn)物清除羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）及1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）的作用，以評(píng)價(jià)不同多酚產(chǎn)物的體外抗氧化活性。結(jié)果表明：正丁醇萃取物中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于乙酸乙酯萃取物；正丁醇萃取物具有更為顯著的體內(nèi)和體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：杜仲葉；多酚；體內(nèi)；體外；抗氧化

杜仲（Eucommia ulmoides）在我國(guó)有著悠久的藥用歷史，其具有降血壓[1-3]、調(diào)節(jié)血糖[4-5]、保護(hù)肝臟[6]、強(qiáng)筋骨[7]等功效。杜仲作為中藥材的使用部位是杜仲皮，然而現(xiàn)代研究表明，杜仲葉與杜仲皮的成分含量相近，甚至某些成分含量較杜仲皮高。天然產(chǎn)物具有很多保健功效，許多研究證明，天然產(chǎn)物的保健功效與其抗氧化作用的聯(lián)系非常緊密[8-14]。杜仲葉中含有較豐富的多酚成分[15]，可以表現(xiàn)出較明顯的抗氧化活性。已有研究表明杜仲具有較強(qiáng)的清除自由基的能力[16]，但研究對(duì)象多為杜仲粗提物，且為其體外抗氧化活性研究，和體內(nèi)抗氧化的研究。本研究采用大孔吸附樹脂分離、有機(jī)溶劑萃取的方法制備杜仲葉多酚，得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，測(cè)定各產(chǎn)物中多酚物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別評(píng)價(jià)各產(chǎn)物的體內(nèi)抗氧化活性和體外抗氧化活性，初步探尋杜仲葉多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與各產(chǎn)物抗氧化活性的相關(guān)性，為杜仲葉保健機(jī)理的研究提供相關(guān)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉：陜西略陽(yáng)杜仲人工繁育基地提供；XDA-8型大孔吸附樹脂：西安藍(lán)曉科技有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；福林酚試劑（Folin-Ciocalteu）、1，1-二苯基-苦基苯肼（DPPH）：美國(guó)Sigma公司；抗壞血酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；鄰二氮菲：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-400A粉碎機(jī)：北京科偉儀器有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；721可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HL-2恒流泵：上海亞榮有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性昆明種小鼠：體重（20±2）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 杜仲葉多酚的制備

采用XDA-8型大孔吸附樹脂對(duì)杜仲葉粗提物進(jìn)行分離。樹脂經(jīng)過預(yù)處理后按照規(guī)定的方法裝柱，將1 BV體積的杜仲葉粗提液以1 BV/h的流速流過樹脂柱，然后用4 BV左右的20%乙醇溶液以1 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，洗脫液減壓濃縮至干，真空冷凍干燥成粉。將樹脂分離產(chǎn)物配置成濃度為200 mg/mL的水溶液，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次所用溶劑與水溶液的體積比為1∶2，合并各有機(jī)相萃取液。收集乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，減壓濃縮至干，真空冷凍干燥成粉。

1.4.2 多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用Folin-Ciocalteu[17]法對(duì)乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算多酚在各干燥后的固體樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.3 動(dòng)物試驗(yàn)方法

小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組、A組和B組，每組40只，分籠飼養(yǎng)。小鼠在SPF動(dòng)物房中飼養(yǎng)，溫度為（23±1）℃，相對(duì)濕度為40%～60%。小鼠先在SPF動(dòng)物房適應(yīng)3 d。用純水將乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物溶解成0.2 g/mL的水溶液。每組小鼠被灌胃飼養(yǎng)。對(duì)照組灌胃純水，A組灌胃乙酸乙酯萃取物，B灌胃正丁醇萃取物。每組每天用灌胃針灌胃1次，按每10 g體重0.1 mL連續(xù)灌胃15 d。各組動(dòng)物在灌胃飼養(yǎng)期間自由飲水和進(jìn)食。

1.4.4 體內(nèi)抗氧化活性

末次灌胃1h后，分別從對(duì)照組、A組和B組取10只小鼠，將小鼠置于水深 30 cm、水溫（25.0±1.0）℃的水箱中游泳90 min，然后立即取出，摘眼球取血，將血液在4 000 r/min下離心10 min后取血清，用分光光度法按照丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒說明檢測(cè)MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力。

1.4.5 體外抗氧化活性

將乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和VC分別配成0.1 mg/mL的水溶液，測(cè)定其對(duì)各自由基的清除能力。羥自由基（HO·）清除能力按照文獻(xiàn)[18]所述方法測(cè)定；超氧陰離子（O2-·）清除能力按照文獻(xiàn)[19]所述方法測(cè)定；1，1-二苯代苦味?；杂苫―PPH·）清除能力按照文獻(xiàn)[20]所述方法測(cè)定。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±S.E.M.）表示，t-檢驗(yàn)法檢驗(yàn)，p＜0.05被視為顯著性差異，p＜0.01被視為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)

經(jīng)測(cè)定，乙酸乙酯萃取物多酚含量為30.45%，正丁醇萃取物多酚含量為61.12%。

2.2 體內(nèi)抗氧化活性

2.2.1 MDA含量

不同產(chǎn)物對(duì)小鼠MDA含量的影響，結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照組相比較，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物均可以顯著減少M(fèi)DA含量（p＜0.05）。

圖1 不同產(chǎn)物對(duì)小鼠MDA含量的影響Fig.1 Effect of products on the SOD activity in mice

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，對(duì)機(jī)體造成損傷，機(jī)體工作能力下降，甚至引發(fā)各種疾病。乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物可以顯著地降低MDA含量，表明二者可以降低脂質(zhì)自由基對(duì)機(jī)體的危害。

2.2.2 SOD活性

不同產(chǎn)物對(duì)小鼠SOD活性的影響，結(jié)果如圖2所示。

2 不同產(chǎn)物對(duì)小鼠SOD活性的影響Fig.2 Effect of products on the content of MDA in mice

與對(duì)照組相比，SOD活性可以被正丁醇萃取物顯著地增強(qiáng)（p＜0.01），但是SOD活性受乙酸乙酯萃取物的影響并不顯著（p＞0.05）。

SOD可以將O2-·還原為H2O2和O2，GSH-Px可以進(jìn)一步將有機(jī)過氧化物和H2O2還原為水和無毒物質(zhì)，因此SOD可以保護(hù)機(jī)體免受自由基的損傷。正丁醇萃取物可以顯著提高SOD活性，表明正丁醇萃取物可以通過提高SOD活性提高機(jī)體清除自由基的能力。

2.2.3 GSH-PX活性

不同產(chǎn)物對(duì)小鼠GSH-Px活性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同產(chǎn)物對(duì)小鼠GSH-Px活性的影響Fig.3 Effect of products on the GSH-Px activity in mice

正丁醇萃取物可以增強(qiáng)GSH-Px活性（p＜0.05），但是乙酸乙酯萃取物對(duì)GSH-Px活性的影響也不顯著（p＞0.05）。

GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶，在機(jī)體內(nèi)廣泛存在。GSH-Px可以清除由活性氧和·OH誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，進(jìn)而有效防止機(jī)體損傷。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1·OH清除效果

不同產(chǎn)物和VC對(duì)·OH清除率結(jié)果如圖4所示。

4 不同產(chǎn)物和VC對(duì)·OH清除率Fig.4 ·OH Scavenging Rate of products and VC

與乙酸乙酯萃取物相比，正丁醇萃取物對(duì)清除·OH的能力非常顯著地高于乙酸乙酯萃取物（p＜0.01），VC對(duì)·OH的清除能力顯著地低于乙酸乙酯萃取物（p＜0.05）；與正丁醇萃取物相比，VC對(duì)·OH的清除能力非常顯著地低于正丁醇萃取物（p＜0.01）。由此可見，正丁醇萃取物具有更強(qiáng)的清除·OH能力，甚至其清除·OH的能力比VC還要高。

2.3.2 對(duì)O2-·清除效果

不同產(chǎn)物和VC對(duì)O2-·清除率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同產(chǎn)物和VC對(duì)O2-·清除率Fig.5 O2-·scavenging rate of products and VC

與乙酸乙酯萃取物相比，正丁醇萃取物和VC對(duì)O2-·清除的能力非常顯著地高于乙酸乙酯萃取物（p＜0.01）；與正丁醇萃取物相比，VC與其對(duì)O2-·清除的能力相當(dāng)（p＞0.05）。由此可見，正丁醇萃取物具有更強(qiáng)的清除O2-·的效果更強(qiáng)，并且其清除O2-·的能力與VC相當(dāng)。

2.3.3 對(duì)DPPH·清除效果

不同產(chǎn)物和VC對(duì)DPPH·清除率，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同產(chǎn)物和VC對(duì)DPPH·清除率Fig.6 DPPH·scavenging rate of products and VC

與乙酸乙酯萃取物相比，正丁醇萃取物和VC對(duì)DPPH·的清除能力與之相當(dāng)（p＞0.05）；與正丁醇萃取物相比，VC對(duì)DPPH·的清除能力也與之相當(dāng)（p＞0.05）。可見，乙酸乙酯萃取物與正丁醇萃取物均具有較高的清除DPPH·的能力，且二者的清除能力與VC相當(dāng)。

3 結(jié)論

1）杜仲葉經(jīng)過大孔吸附樹脂分離、有機(jī)溶劑萃取后，得到乙酸乙酯相和正丁醇相兩種多酚純化產(chǎn)物，正丁醇萃取物中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于乙酸乙酯萃取物。

2）正丁醇萃取物具有更為顯著的體內(nèi)和體外抗氧化活性，即多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的萃取物其抗氧化活性也較高。

3）本研究為杜仲葉多酚抗氧化特性的研究提供了一定的理論支持。

4）建議進(jìn)一步分離純化杜仲葉多酚，得到純度更高的杜仲葉多酚產(chǎn)物，研究高純度杜仲葉多酚產(chǎn)物的抗氧化活性，為杜仲葉多酚抗氧化特性理論研究提供更有力的證實(shí)。

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The Antioxidation Activity in Vivo and in Vitro of Poyphenols Separated from Eucommia ulmoides Leaves

LIU Di1， SHANG Hua1， SONG Xiao-yu2
（1.Department of Chemical Engineering and Textile， Shaanxi Polytechnic Institute， Xianyang 721000，Shaanxi， China；2.Shaanxi Haisheng Fresh Fruit Juice Co.， Ltd.， Qian County Branch， Qian County 713300，Shaanxi， China）

Abstract：In order to study the antioxidation activity invivoand invitroof polyphenols separated fromEucommia ulmoidesleaves，theEucommia ulmoidesleaves were separated by resin and organic solvent and then ethyl acetate extract and butyl alcohol extract were gotten.The polyphenols in the extracts were tested for content.The content of malondialchehyche （MDA），the activity of superoxide dismutase （SOD）and glutathione peroxidase （GSH-Px） were investigated in mice to evaluate the antioxidation activity invivo.The scavenging capacity of the extracts on HO·， O2-·and DPPH·were tested to evaluate the antioxidation activity invitro.The result showed that the content of polyphenols in butyl alcohol extract was higher than that in ethyl acetate extraction，and butyl alcohol extract showed more significant antioxidation activity in vivo and in vitro.

Key words：Eucommia ulmoidesleaves；polyphenols；invivo；invitro； antioxidation

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.09.002

陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目[蘋果渣中根皮苷的提取分離研究（12JK0600）]；陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院自選科研計(jì)劃項(xiàng)目[多酚物質(zhì)根皮苷的制備研究（ZK11-31）]

劉迪（1980—），女（漢），博士，研究方向：化學(xué)新材料的制備。

2012-08-18