中醫(yī)藥對(duì)卵巢TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的干預(yù)及思考

申可佳，尤昭玲

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

中醫(yī)藥能促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，改善卵巢功能和卵母細(xì)胞質(zhì)量，輔助提高妊娠率，這些療效通過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐已得到肯定，但作用機(jī)制未完全闡明。以往的研究多集中在補(bǔ)腎中藥對(duì)卵巢相關(guān)細(xì)胞因子及受體表達(dá)的影響、對(duì)性腺軸激素及受體的調(diào)節(jié)等方面，關(guān)于這些被調(diào)節(jié)的因素最終通過(guò)何種分子機(jī)制產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)不甚明了。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是指細(xì)胞接受外源信號(hào)，將其轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號(hào)，最終調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)的過(guò)程。卵巢內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常復(fù)雜，包括G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、蛋白酪氨酸激酶（PTK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、蛋白絲/蘇氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等，現(xiàn)已證實(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控卵泡發(fā)育的重要途徑[1-2]。本文綜合近年文獻(xiàn)，首先總結(jié)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)卵泡發(fā)育的調(diào)控，然后分析目前中藥對(duì)此通路的干預(yù)作用，希望能對(duì)中藥作用機(jī)制的研究有所啟發(fā)和幫助。

1 卵巢內(nèi)的TGF-β超家族/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

TGF-β超家族/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路屬于蛋白絲/蘇氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，由TGF-β超家族、TGF-β超家族受體和Smads蛋白家族三部分組成。

TGF-β超家族 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)、功能多樣的細(xì)胞因子家族，主要包括TGF-β、激活素（Activin）、骨形成蛋白（BMP）、生長(zhǎng)分化因子（GDF）等，它們參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的多種生理活動(dòng)，在卵泡的發(fā)育中也起著重要作用[3-4]。

1.1 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）

多種組織細(xì)胞可合成TGF-β，以自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。目前發(fā)現(xiàn)至少有5個(gè)亞型，分別為T(mén)GF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5，各亞型在許多生物反應(yīng)中表現(xiàn)出相似的作用。其中TGF-β1所占比例最高（＞90%），活性最強(qiáng)，是一種多功能的細(xì)胞活性調(diào)節(jié)因子，在胚胎發(fā)生、脂肪形成、肌肉形成、軟骨形成、骨發(fā)生、上皮細(xì)胞分化、纖維發(fā)生以及免疫細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[5]。

1.2 激活素（activin）、抑制素（inhibin）、卵泡抑素（follistatin）即ACT-INH-FS

ACT-2NH-FS系統(tǒng)均為T(mén)GF-β超家族成員，主要由垂體和卵巢顆粒細(xì)胞分泌。抑制素有抑制素A（INHA）及抑制素B（INHB）2種化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的亞型，兩者均可選擇性反饋抑制垂體促卵泡素（FSH）的合成和分泌，在卵泡募集和優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇中起作用。激活素有激活素A（ACTA）、激活素B（ACTB）和激活素AB（ACTAB）3種亞型，為抑制素的同源或異源二聚體（激活素A：βAβA，激活素B：βBβB）及異源二聚體（激活素AB：βAβB），其作用與抑制素相反，可以促進(jìn)垂體FSH分泌，調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的分化，激活素A還有促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用。卵泡抑素（FS）是激活素的結(jié)合蛋白，通過(guò)與激活素的不可逆結(jié)合間接抑制FSH的合成與分泌，對(duì)抗激活素對(duì)卵泡的作用。目前認(rèn)為ACT-INHFS作為一個(gè)系統(tǒng)，通過(guò)內(nèi)分泌途徑對(duì)垂體FSH的合成和分泌進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，并在卵巢局部通過(guò)自分泌或旁分泌的途徑，調(diào)節(jié)卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞對(duì)促性腺激素的反應(yīng)性，故此系統(tǒng)與卵泡的發(fā)育密切相關(guān)，是參與卵泡發(fā)育的主要的卵巢內(nèi)部因子[6-9]。

1.3 抗苗勒氏管激素（AMH）

AMH是TGF-β超家族成員之一，參與卵泡的發(fā)育過(guò)程。AMH在始基卵泡中無(wú)表達(dá)，在竇前卵泡和小竇卵泡（直徑≤4 mm）的顆粒細(xì)胞中高表達(dá)，在4～8 mm卵泡中表達(dá)量逐漸下降，而在8 mm以上的竇卵泡中AM H表達(dá)消失，在閉鎖卵泡中亦無(wú)表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)AMH主要通過(guò)抑制始基卵泡發(fā)育的起始及抑制卵泡對(duì)FSH的敏感性這兩方面來(lái)抑制卵泡發(fā)育，并且發(fā)現(xiàn)AMH是預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備功能和卵巢反應(yīng)性的良好指標(biāo)之一[10-11]。

1.4 骨形成蛋白（BMP）

目前的研究已發(fā)現(xiàn)BMP有10多種亞型，由不同的細(xì)胞在卵泡發(fā)育的不同階段分泌，比如BMP-15是卵母細(xì)胞來(lái)源的因子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明其能調(diào)控周?chē)w粒細(xì)胞的分裂，對(duì)正常卵母細(xì)胞發(fā)育及生殖功能具有重要的影響[12]。BMP-6可由卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞分泌，目前認(rèn)為可能與優(yōu)勢(shì)卵泡形成后的卵泡閉鎖相關(guān)。顆粒細(xì)胞還能分泌BMP-2和BMP-3，有研究顯示BMP-2重組體可以增強(qiáng)綿羊顆粒細(xì)胞中的FSH引導(dǎo)的雌激素（E2）和抑制素A的產(chǎn)生， 刺激抑制素B亞組mRNA的表達(dá)以及體外培養(yǎng)的人類(lèi)粒層黃體細(xì)胞中抑制素B蛋白的產(chǎn)生。BMP-3在卵巢中的生化作用還不清楚。已有發(fā)現(xiàn)大鼠的卵泡膜細(xì)胞可以產(chǎn)生BMP-3b、BMP-4和BMP-7，其中BMP-4和-7的重組體可以通過(guò)促進(jìn)FSH誘導(dǎo)的E2的生成和抑制孕酮的生物合成來(lái)調(diào)控FSH的信號(hào)傳導(dǎo)[13]。

1.5 生長(zhǎng)分化因子（GDF）

GDF-9 和GDF-9B主要在人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物的卵巢表達(dá)，GDF-9是卵泡正常生長(zhǎng)發(fā)育必需的細(xì)胞因子，它通過(guò)自分泌方式促進(jìn)卵母細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，通過(guò)旁分泌的方式調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞的增殖分化，同時(shí)影響卵巢內(nèi)類(lèi)固醇激素、蛋白酶及其他細(xì)胞因子的分泌[14]。GDF-9B可能通過(guò)和GDF-9共同作用來(lái)調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的功能， 比如促性腺激素誘導(dǎo)的增生和分化[13-14]。

選取2017年3月～2018年5月我院內(nèi)接診的帶狀皰疹神經(jīng)痛患者82例作為研究對(duì)象，按照治療措施的差異將其分為兩組。其中，對(duì)照組男20例，女21例，年齡22～55歲，平均（56±1.44）歲，體質(zhì)量70～85 kg，平均（80.44±1.25）kg；觀察組男15例，女26例，年齡21～55歲，平均（50.85±1.79）歲，體質(zhì)量72～85 kg，平均（80.44±1.12）kg。對(duì)比分析兩組患者一般資料，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2 TGF-β超家族受體[5,15-16]

TGF-β超家族受體通過(guò)與配體（TGF-β超家族）的結(jié)合及活化，啟動(dòng)Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前共發(fā)現(xiàn)8種受體，即受體Ⅰ（TβRⅠ），受體Ⅱ（TβRⅡ），受體Ⅲ（TβRⅢ），受體Ⅳ（GH3），Endoglin，PLBPs（含有可結(jié)合TGF-β1和TGF-β2的兩種受體），GI-210。其中研究得比較清楚的為T(mén)βRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ，這3種受體具有較高的同源性，且TβRⅠ和TβRⅡ 均為具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分為細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)絲-蘇氨酸蛋白激酶區(qū)。

2.1 TβRⅠ又稱(chēng)為活化素樣蛋白激酶（Alks），可分為Alk5、Alk3和Alk1三個(gè)亞群。

Alk5亞群包括TGF-βⅠ型受體Alk5、激活素受體Alk4和Nodal受體Alk7；Alk3亞群包括BMPⅠ型受體Alk3和Alk6；Alk1亞群包括同BMP /GDF和TGF-β/Activin作用的Alk1和Alk2。TβRⅠ的C端含有一個(gè)保守的Gs結(jié)構(gòu)域（Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly），是接受TβRⅡ磷酸化激活的部位，具有傳遞信號(hào)的作用。

2.2 TβRⅡ 包括TGF-βRⅡ，Activin RⅡ，Activin RⅡB，BMP /GDFⅡ型受體（BMP RⅡ），AMH的Ⅱ型受體（M IS RⅡ）。

2.3 TβRⅢ 亦稱(chēng)為β烯糖，無(wú)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)，但可提高配體對(duì)TβRⅡ的親和力。

3 Smads蛋白家族[5,17-18]

Smads蛋白家族是目前已被證實(shí)和公認(rèn)的TGF-β超家族受體作用的底物，能將從TGF-β獲得的信息傳遞到細(xì)胞核內(nèi)。Smads家族的蛋白結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，一級(jí)結(jié)構(gòu)由三部分組成：高度保守的氨基端即MH1區(qū)、高度保守的羧基端即MH2區(qū)以及富含脯氨酸的連接區(qū)。在介導(dǎo)TGF-β超家族信號(hào)時(shí)，MH1區(qū)發(fā)揮與DNA結(jié)合的作用，MH2結(jié)構(gòu)域可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)Smads蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的不同作用可將其分為3類(lèi)：（1）受體激活型Smads（receptor-activated Smads）或途徑限制型（pathway-restricted Smad）：即R- Smads，包括Smad 1、2、3、5、8、9、10。其中Smad 1、5、8、9參與BMP的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Smad2、3 參與TGF-β和Activin的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而Smad10主要參與激活BMP 拮抗劑（神經(jīng)誘導(dǎo)及發(fā)育的關(guān)鍵因子）與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）的活性。（2）共同介質(zhì)型或通用型Smads：即co-Smads，包括Smad4，有1個(gè)富含脯氨酸的Smad4活化區(qū)，是激活依賴(lài)Smad蛋白的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必需的。Smad4可以與所有已活化的R-Smads結(jié)合，是BMP、TGF-β和Activin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同通路。（3）抑制型Smads：即I-Smads，包括Smad6、7，可拮抗R-Smads介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，形成控制TGF-β超家族作用的負(fù)反饋環(huán)路。

4 卵巢內(nèi)TGF-β超家族信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[5,7,11,13-18]

TGF-β超家族成員（配體）在細(xì)胞外先與TβRⅢ形成復(fù)合物，再被傳遞給處于自動(dòng)磷酸化的TβRⅡ，或配體直接與TβRⅡ結(jié)合形成二元復(fù)合物，隨后磷酸化激活TβRⅠ，形成三元/二元復(fù)合物，使TβRⅠ在靶細(xì)胞內(nèi)與膜受體偶聯(lián)的GS區(qū)活化，并與之形成信號(hào)復(fù)合物，隨后激活R-Smads蛋白MH2區(qū)的受體磷酸化位點(diǎn)（SSXS基序）。活化的R- Smads與co-Smads即Smad4形成異多聚體， 然后進(jìn)入細(xì)胞核中，通過(guò)Smad4和Smad3的M H1區(qū)與DNA上的Smad結(jié)合元件松散結(jié)合，在局部一些轉(zhuǎn)錄共激活因子和／或共抑制因子的影響下，MH2區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活序列與靶基因形成緊密結(jié)合，最終實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。I-Smads不能被受體磷酸化，但可競(jìng)爭(zhēng)性地與活化的TβRⅠ牢固結(jié)合，阻止R-Smads的磷酸化，從而負(fù)反饋控制TGF-β信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。

4.1 Smad2/Smad3介導(dǎo)的通路

已證實(shí)TGF-β、Ac tiv in、GDF-9可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)Smad2/Smad3的介導(dǎo)完成信號(hào)傳遞。

4.1.1 GDF-9來(lái)源于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，通過(guò)自分泌和旁分泌方式作用于靶細(xì)胞（卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞）的BMP RⅡ，再激活受體Alk5，隨后激活靶細(xì)胞內(nèi)Smad2/ Smad3，活化的Smad2/Smad3與Smad4形成多聚體，進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前已發(fā)現(xiàn)GDF-9可以引起顆粒細(xì)胞的透明質(zhì)酸合成酶2（Has2）、環(huán)氧化酶2（Cox2）和類(lèi)固醇生產(chǎn)的敏感調(diào)節(jié)蛋白（StAR） mRNA的表達(dá)， 而抑制尿激酶型纖溶酶原激活物（uPa）和黃體化激素受體（LHR）的表達(dá)。

4.1.2 ACT、INH、FS來(lái)源于卵巢顆粒細(xì)胞，在卵巢內(nèi)部通過(guò)自分泌和旁分泌方式作用于顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞，其中ACT作用于靶細(xì)胞的activin RⅡ，再激活受體Alk4，隨后激活靶細(xì)胞內(nèi)Smad2/Smad3，并與Smad4形成多聚體，進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前發(fā)現(xiàn)ACT可調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的分化， 并且和卵泡的發(fā)育階段相關(guān)。體外培養(yǎng)未分化的大鼠顆粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)ACT可促進(jìn)其表達(dá)芳香化酶、促卵泡素（FSH）和黃體生成素（LH）受體， 刺激雌二醇（E2）和孕酮（P）的分泌，并且上述作用不依賴(lài)于FSH，但可被FSH增強(qiáng)。同時(shí)，ACT促進(jìn)顆粒細(xì)胞INH的基礎(chǔ)分泌和FSH誘導(dǎo)的分泌及其INH亞單位的表達(dá)。INH、FS的信號(hào)通路暫未明確。

4.1.3 TGF-β由卵母細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生，作用于顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的TGF-βRⅡ，再激活受體Alk5，接下來(lái)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑同GDF-9。

4.2 Smad1/ Smad5/ Smad8介導(dǎo)的通路

已證實(shí)BMP、AMH可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)Smad1/ Smad5/ Smad8的介導(dǎo)完成信號(hào)傳遞。

4.2.1 BMP 卵母細(xì)胞分泌BMP-15和BMP-6，顆粒細(xì)胞分泌BMP-2、BMP-3、BMP-6、BMP-7，卵泡膜細(xì)胞分泌BMP-3、BMP-4、BMP-7，這些亞型均可通過(guò)旁／自分泌作用于靶細(xì)胞的BMP RⅡ，然后激活受體Alk2，Alk3和Alk6，活化的受體在磷酸化激活細(xì)胞內(nèi)Smad1/ Smad5/ Smad8，后者與Smad4形成多聚體，進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。不同亞型引起的生物學(xué)效應(yīng)見(jiàn)前述（1.4）。

4.2.2 AMH由卵巢顆粒細(xì)胞表達(dá)，作用于顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞的MISRⅡ，然后激活受體Alk2，Alk3和Alk6，接下來(lái)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑同BMP。

5 中醫(yī)藥對(duì)卵巢內(nèi)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的干預(yù)及思考

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及胞外配體、跨膜受體、胞內(nèi)各種信使分子等，機(jī)體某種生理和病理現(xiàn)象的產(chǎn)生往往涉及眾多的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且多條通路錯(cuò)綜復(fù)雜，譬如卵泡的發(fā)育，是眾多細(xì)胞因子和激素（胞外配體）通過(guò)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)控的，很多過(guò)程還未弄清楚。所以選取一條研究得比較成熟、已得到公認(rèn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路很關(guān)鍵，TGF-β超家族/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)就是目前已被證實(shí)的、和卵泡發(fā)育密切相關(guān)的通路。以往文獻(xiàn)報(bào)道的大部分研究集中在中醫(yī)藥對(duì)卵巢內(nèi)TGF-β超家族（配體）的調(diào)節(jié)，如對(duì)ACT-INH-FS、AMH、BMP、TGF-β1等的調(diào)節(jié)，對(duì)受體和胞內(nèi)信號(hào)分子的研究較少，對(duì)細(xì)胞內(nèi)Smads蛋白的干預(yù)研究更是鳳毛麟角，如孫麗萍等[18]報(bào)道四物合劑通過(guò)升高小鼠卵巢顆粒細(xì)胞P-Smad2/3的表達(dá)以維持芳香化酶表達(dá)水平的正常，維持卵巢的正常分泌功能，對(duì)卵巢形態(tài)和顆粒細(xì)胞增殖亦有保護(hù)性作用，對(duì)于臨床防治化療性卵巢早衰具有一定的可行性。崔瑞琴等[19]報(bào)道菟絲子黃精顆粒劑可干預(yù)和修復(fù)雷公藤多苷所致雌鼠卵巢損傷，其機(jī)制是菟絲子、黃精可以促進(jìn)被雷公藤多苷所抑制的卵巢組織中Smad4 mRNA的表達(dá)。雖然中醫(yī)藥干預(yù)卵巢細(xì)胞內(nèi)Smads蛋白的文獻(xiàn)很少，但已發(fā)現(xiàn)較多中醫(yī)藥干預(yù)骨質(zhì)疏松癥骨組織和下丘腦等部位TGF-β/Smad轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究[20-23]，這些研究為中藥對(duì)卵巢內(nèi)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的干預(yù)揭開(kāi)冰山一角，啟發(fā)我們從新的角度闡明中醫(yī)藥干預(yù)卵泡發(fā)育的機(jī)制。

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