膠體金免疫層析技術(shù)在食源性致病菌快速檢測中的應用

李 宏 付冠艷 付淑君 鐘菲菲

劉 佩2 曾 林2 楊麗霞2

（1.中國合格評定國家認可中心，北京 100062；2.長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，湖南 長沙 410013）

世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計報告［1］表明，食源性疾病的實際發(fā)病數(shù)要比報告的病例數(shù)多300～500倍，全世界因食物污染而致病者已達數(shù)億。發(fā)展中國家常見的食源性疾病包括霍亂、大腸桿菌感染、沙門氏菌病、志賀氏菌病等。中國疾病預防控制中心資料［2，3］顯示，近10年來，由微生物引起的食源性疾病事件中，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別占17.9%，8.9%，5.6%，是最常見和最主要的病因物質(zhì)。2000～2005年湖南省共發(fā)生食物中毒325起，中毒8 998人，死亡85人。中毒場所以家庭發(fā)生最多，占總中毒起數(shù)的45%，中毒人數(shù)以集體食堂最多，中毒原因中以化學性和生物性食物中毒發(fā)生起數(shù)最高，占總發(fā)生起數(shù)的45%［4］。因此，建立一種便捷、快速、準確的檢測技術(shù)，對于避免食源性致病菌污染，降低中毒事件的發(fā)生率具有重要意義。

目前食源性致病菌的檢測仍以傳統(tǒng)方法為主，細菌分離、培養(yǎng)及生化鑒定耗時長、操作繁瑣、環(huán)境及主觀因素影響較 大［5］；生 化 鑒 定 法［6］和 PCR 法［7，8］等 不 僅 需 要 昂 貴 的 設備，還需要較高的技術(shù)要求和資金投入，制約了在現(xiàn)場快速檢測中的應用。膠體金免疫層析技術(shù)是在20世紀80年代初發(fā)展起來的，具有簡單、快速、廉價、適應性廣等優(yōu)點［9－11］，可在基層單位進行各種食源性致病菌的快速篩查。膠體金免疫試紙條作為一種簡單快速的檢測技術(shù)，無需洗滌，不需要貴重儀器設備，且特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好、可單份測定，全過程只需15min左右，結(jié)果易于判斷，成為目前生物快速檢測的主要方法之一。

1 膠體金免疫層析技術(shù)

1.1 膠體金免疫層析原理

膠體金免疫層析技術(shù)將金標技術(shù)、免疫技術(shù)和層析技術(shù)相結(jié)合，是一種固相標記免疫技術(shù)［12］。其原理是在硝酸纖維素膜的某一區(qū)段固定特異性抗體，把該硝酸纖維素膜一端浸入樣品溶液后，由于毛細管作用，樣品將向該膜的另一端移動，當移動到固定有抗體的區(qū)段時，樣品中相應的抗原即與該抗體特異性結(jié)合，該區(qū)域便呈現(xiàn)一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性免疫檢驗［13］，該法通常有雙抗體夾心和競爭法兩種形式。

1.2 操作步驟

1.2.1 膠體金的制備 膠體金又稱金溶膠，是金鹽被還原成金后形成的金顆粒懸液，它具有一般溶膠的特性［14］。膠體金溶液的制備方法有化學還原法、電化學還原法、高分子保護法、反膠團法等［15］，最經(jīng)典的還是1973年Frens建立的檸檬酸還原法［16］，目前該法仍然是制備納米金的首選［17］。

1.2.2 膠體金標記蛋白質(zhì) 膠體金標記蛋白質(zhì)反應的機制至今仍無確切結(jié)論。一般認為：由于膠體金顆粒表面帶負電荷，蛋白質(zhì)表面帶正電荷，二者通過靜電作用相結(jié)合［18］。也有人提出不同的觀點，Oliver［19］認為膠體金不僅展示了靜電荷特性，同時也展示了疏水特性，膠體金粒子的表面存在帶負電荷的疏水性基團，可與待標記蛋白通過疏水相互作用結(jié)合。標記前用K2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH值［20］至略大于蛋白等電點［21］0.5個pH 單位，這時蛋白質(zhì)呈電中性［22］，不會因為靜電引力而聚集。膠體金標記蛋白最重要的是選擇合適的pH值和抗體（抗原）的用量，沉淀用含少量穩(wěn)定劑的溶液懸?。?3］即可。

1.2.3 膠體金試紙條的制備 膠體金試紙條一般由樣品墊、金標墊、層析膜、吸水墊四部分組成。層析材料有硝化纖維膜（NC）、聚酯膜、尼龍膜和PVDF膜等［24］，根據(jù)試驗需要可選擇不同要求的膜，其中NC膜最為常用，使用前可根據(jù)試驗具體情況確定是否需要活化或處理，多數(shù)情況下無需處理，即可直接使用。周文達等［25］通過化學法證明活化后的NC膜可大大提高檢測穩(wěn)定性和靈敏度。

將金標蛋白溶液均勻噴涂在金標墊上，于室溫下晾干備用。NC膜可捕獲一定量的包被抗原（抗體）和二抗作為檢測線和質(zhì)控線。最后將樣品墊、金標墊、NC膜和吸水紙依次固定于PVC板，即成試紙條［26］。試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)，密封保存。密封的測試條室溫下一般可保存6～18個月。

2 在食源性致病菌快速檢測中的應用

2.1 沙門氏菌的檢測

沙門氏菌是食源性疾病中最常見的病原菌，2003～2005年中國食源性疾病中沙門氏菌占微生物的17.2%，排在第2位［27］。美國疾病控制和預防中心數(shù)據(jù)顯示：在1997年大約有30萬個腸炎沙門氏菌感染引起的病例，傳染源多為雞蛋［28］。Seo等［28］用免疫層析試紙條檢測純培養(yǎng)和雞蛋中的沙門氏菌，得到最低檢測限分別為1×107，1×108CFU／mL；陳瓊等［29］用自制的沙門氏菌膠體金試紙條最低可檢測2.3×105CFU／mL。

2.2 大腸桿菌O157的檢測

在食源性病原微生物中，腸出血性大腸桿菌占有重要地位，其主要包括 O157：H7、O26：H11和 O111，O157：H7是出血性腸炎的主要致病菌［30－32］。1982年，O157：H7在美國被發(fā)現(xiàn)，此后在世界各地散發(fā)或地方流行。1996年在日本大阪地區(qū)發(fā)生O157：H7流行，患者逾萬，死亡11人。2001年在中國江蘇、安徽等地發(fā)生了多次食源性感染O157：H7事件，導致177人死亡［13］。王靜等［33］用膠體金法檢測奶粉、面粉、淀粉等樣品中的大腸桿菌O157，得到最低檢測限為1×105CFU／mL；黃嶺芳等［34］用此法檢測牛肉、萵苣等樣品中的大腸桿菌O157，得到最低檢測限為1×104CFU／mL。

2.3 單核細胞增生李斯特菌的檢測

單核細胞增生李斯特氏菌能引起人畜共患疾病，它是某些食物（主要是鮮奶產(chǎn)品）中的一種污染物，能引起敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多，導致嚴重食物中毒，病死率高達30%～70%［35］。崔煥忠等［36］利用原核表達系統(tǒng)表達致病性李斯特菌特異性蛋白－肌動蛋白聚合蛋白（actin polymerizing protein，ActA），制備單增李斯特菌特異性抗體，研制出該菌的膠體金檢測試紙，蔬菜、牛奶中的最低檢出限為3.9×105CFU／mL。

2.4 金黃色葡萄球菌的檢測

金黃色葡萄球菌在空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到，因而食品受其污染的機會很多。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性難題，在美國由其引起的食物中毒占整個細菌性食物中毒的33%，在加拿大則占到45%［37］。目前，在金黃色葡萄球菌診斷方面，Hoover等［38］利用生化方法準確地鑒定出此菌；Rall等［39］利用PCR法進一步找出了其腸毒素基因，這些方法雖然精確、敏感，但需要精密儀器設備，費時且成本高，目前難以在基層單位推廣應用，膠體金檢測法讓這些難題有了解決的方向。劉洪貴等［40］通過自制多克隆抗體，制備免疫膠體金來檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，靈敏度可達1×104CFU／mL；Su－Hua Huang等［41］利用金黃色葡萄球菌的一種代謝產(chǎn)物是蛋白A的特性，通過在納米金表面標記抗蛋白A的IgG制備試紙條，檢測豬肉、牛肉中的金黃色葡萄球菌，靈敏度高達25CFU／g。

2.5 豬鏈球菌的檢測

豬鏈球菌是革蘭氏陽性菌，在自然界中分布廣泛，可引起豬的敗血性和局灶性淋巴結(jié)化膿性病癥，能通過受傷的皮膚和黏膜感染人［42，43］，引起人的腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎，極少數(shù)可以造成永久性失聰［44－46］。Ying Ju等［47］通過自制抗豬鏈球菌的多克隆抗體來制備膠體金試紙條，檢測靈敏度可達1×106CFU／mL。

3 展望

目前，膠體金免疫試紙條在食源性致病菌檢測領域還沒有中國國產(chǎn)成型的產(chǎn)品，仍處于實驗室研究階段，進一步提高檢測靈敏度、實現(xiàn)多元檢測及現(xiàn)場定量檢測是未來發(fā)展的方向。由于致病菌種類繁多，同種致病菌又存在多個亞種，這使得如何獲得高特異性抗體成為膠體金免疫試紙法成功的關鍵和難點，探索致病菌在體內(nèi)的受體可為高特異性抗體的獲得提供研究方向。

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