去勢雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型的研究

王鍵，龔顏，曾榮，魏勁松

（廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨外科，廣東湛江524001）

·綜述·

去勢雌性大鼠骨質(zhì)疏松模型的研究

王鍵，龔顏，曾榮，魏勁松

（廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨外科，廣東湛江524001）

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis)主要表現(xiàn)為骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退行性改變等特征，以致骨脆性、骨折危險性增加的代謝性全身骨骼疾病。合適的骨質(zhì)疏松動物模型是研究骨質(zhì)疏松癥的重要基礎(chǔ)。本文就絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松雌性大鼠模型復制的基本方法、月齡和造模的選擇及常用的評價指標特點簡要綜述，為研究去勢骨質(zhì)疏松疾病動物的正確選擇提供參考。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松；大鼠；動物模型

骨質(zhì)疏松（Osteoporosis，OP）是多病因引起的，以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退行性改變?yōu)樘卣?，以致骨脆性、骨折危險性增加的代謝性全身骨骼疾病。OP按病因可分為原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性三類，其中，Ⅰ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松即絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，發(fā)生于絕經(jīng)后女性人群中，其主要病理機制與破骨細胞骨吸收功能活躍為主因的骨重建失去平衡有關(guān)。在研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的藥理、機制等過程中，諸如小鼠、大鼠、兔、狗、豬、羊等[1]動物模型都有被采用。實驗動物合理的選擇要求符合方便性、相關(guān)性和適宜性三大原則，且具有可重復性的穩(wěn)定性，盡量使OP在組織病理學上與人類表現(xiàn)一致。而大鼠去勢后骨礦含量下降、骨吸收迅速增加[2]、骨骼強度下降[3]等表現(xiàn)均與人類有眾多的相似之處，相對其他動物模型來說，具有繁殖快、花費低、易于飼養(yǎng)和管理、遺傳背景明確等優(yōu)點，已被作為最常用的動物模型，現(xiàn)廣泛運用于評價和開發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松治療新藥等研究[4]。本文就近幾年骨質(zhì)疏松研究中雌性大鼠去勢模型的研究綜述如下：

1 大鼠種類的選擇

實驗用大鼠分遠交和近交系，其中遠交系有Spraque-Dauley、Wistar、Holtzman、Long-Evans等，近交系包括Fischer344、ACI、Brown-Norway、Wistar-Furth、Lewis等品種。目前最常用的是Wistar大鼠和Spraque-Dauley大鼠（SD大鼠）。

2 模型制備方法

目前國內(nèi)外研究大多使用經(jīng)典的手術(shù)切除雙側(cè)卵巢造模，該模型很好地模擬出人體雌激素下降造成的破骨細胞活動加速、成骨細胞功能代償性增強的高轉(zhuǎn)換型骨代謝等特點[5]，而且處理因素單一，成模效果肯定，實驗結(jié)果可靠性好，可較快地復制出OP模型。但臨床OP患者在絕經(jīng)后卵巢間質(zhì)細胞仍有一定程度的內(nèi)分泌功能[6]；其次，與人類骨骼相比，大鼠皮質(zhì)骨缺乏Haversian系統(tǒng)及皮質(zhì)內(nèi)改建[7]，不適于用作研究臨床上卵巢切除術(shù)對皮質(zhì)骨影響的模型；最后，手術(shù)造模是一項創(chuàng)傷性操作，難免會引起機體應(yīng)激反應(yīng)、電解質(zhì)紊亂等[8]。以上的模型缺點都可能會對實驗的結(jié)果產(chǎn)生一定影響，限制了該模型完全模擬臨床OP的應(yīng)用。

不摘除卵巢而是給予藥物，會造成體內(nèi)雌激素的含量減少，經(jīng)過一定時間后，也可以造成動物的骨丟失?？捎玫乃幬镉写冱S體激素釋放激素激動劑[1，9](Luteinizing hormone-releasing hormone agonist，LHRHAs)、促性腺激素釋放激素激動劑[10](GnRH agonist)以及非甾體類雄激素拮抗劑[1，5]等，均可使體內(nèi)雌二醇減少，達到藥物模擬去勢的效果。給藥法雖然不產(chǎn)生動物應(yīng)激反應(yīng)、電解質(zhì)紊亂等問題，但是這種方法可能涉及兩種或更多激素之間的作用，并且藥物副作用不可避免，這些可能會與研究處理因素產(chǎn)生相互影響，成模效果不確定，人為地增大實驗復雜性，因此降低實驗結(jié)果可信度，實際應(yīng)用有限。

3 造模大鼠月齡和成模時間的選擇

一般而言，大鼠2個月齡時性成熟，17～18個月齡后進入老年期，平均壽命3年。合適月齡的大鼠對于OP的實驗研究十分關(guān)鍵。

對正常非手術(shù)未孕產(chǎn)的雌性大鼠，王曉等[5]比較后認為，3～6個月齡骨生長活躍；6、7個月齡骨骺出現(xiàn)封閉，骨代謝相對穩(wěn)定；10個月齡后出現(xiàn)峰值骨量；而骨生物力學效能達峰值12個月齡時才出現(xiàn)；12～16個月齡則更多地表現(xiàn)為骨量的快速丟失。因此針對不同月齡的特點，可以通過對3～6個月齡大鼠施加不同的因素，研究骨量形成的影響；在骨代謝相對穩(wěn)定的6、7個月齡大鼠，不僅可施加手術(shù)去勢、藥物干預、懸吊固定等處理來觀察實驗因素對骨質(zhì)平衡的影響，也可以長期藥物喂養(yǎng)，研究藥理對OP的預防作用；12個月齡之后的大鼠由于主要表現(xiàn)在骨量的丟失，因此適合用于老年人骨量峰值過后骨質(zhì)丟失治療的應(yīng)用實驗。由于去勢后的長期雌激素缺乏，16～24個月齡的大鼠乳腺腫瘤的發(fā)病率上升[11]，已不適用于骨代謝治療的研究。

目前大多學者采用3～9個月齡的大鼠進行實驗。有學者對不同月齡大鼠卵巢切除術(shù)后觀察比較指出[12-14]，3個月齡大鼠骨骼還處于生長期，在術(shù)后2個月內(nèi)骨礦含量仍有增加，6～8個月齡鼠大鼠骨峰形成相對穩(wěn)定，性激素減少導致骨質(zhì)的變化更符合絕經(jīng)后女性的變化規(guī)律，而12個月齡的SD大鼠由于骨密度與骨鈣含量的變化較小，因此適宜用于復制老年性的骨質(zhì)疏松。

由于成年大鼠的骨重建周期為30～40 d[15]，理論上去勢處理后1～2個月內(nèi)即可進行藥物干預。劉曉青等[16]通過去勢后4周、12周和18周的觀察，發(fā)現(xiàn)去卵巢前4周時間內(nèi)骨量降低最快，隨后速度減慢?？紤]到即使在去卵巢后，大鼠的骨形成和骨吸收的變化也受到其月齡增長的影響，因此術(shù)后1個月較適宜運用于藥物治療的實驗處理。

已產(chǎn)仔的雌性大鼠，因動物在孕期和哺乳過程中，體內(nèi)對鈣需求高于正常，多有可能出現(xiàn)骨骼生長緩慢，以及影響實驗中血鈣等數(shù)值的測量。因此在一般的OP治療的研究中，應(yīng)盡量選用未孕產(chǎn)的雌性大鼠，避免上述因素的干擾。

綜上所述，不同種族的大鼠雖然生活習性和生長曲線不盡相同，但都可以成功的制作出模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的模型。考慮到去勢后飼養(yǎng)和藥物治療的時間對大鼠的月齡也會造成影響，選擇6個月齡大鼠去除卵巢后1個月比較適用于藥物治療OP的實驗研究。此時大鼠術(shù)后的骨量丟失明顯，骨吸收活躍，耦聯(lián)骨形成增加明顯，形成高轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松特點，較符合絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的特點，制模時間較短，成模效果肯定，可以較好地節(jié)省實驗時間和經(jīng)費。

4 大鼠模型較常用的部分評價和判斷指標

4.1 反映卵巢切除的指標卵巢是否成功切除干凈，不僅要將切除物組織鏡檢，還要通過術(shù)后連續(xù)兩周的每天陰道分泌物涂片鏡，觀察子宮內(nèi)膜組織學變化，一般來說，大鼠性周期為96～120 h，可以在術(shù)后較快地明確雙側(cè)卵巢切除是否徹底。也可在處死大鼠后行子宮質(zhì)量稱重和子宮系數(shù)的比較，進一步從功能上說明卵巢切除成功，雌激素減退。子宮系數(shù)=子宮質(zhì)量/體質(zhì)量[17]。血液的改變主要表現(xiàn)在雌二醇的變化，可以通過測定血清雌二醇來證明達到絕經(jīng)后的標準。

4.2 骨量變化的常用指標按照中國人原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標準，要求骨量丟失大于均值的25%才可診斷為OP，因此骨密度的測量為必須反映骨質(zhì)疏松造模成功與否的指標，該標準目前主要以DXA (雙能X線吸收法)為手段制定，輔以多種方法的應(yīng)用。因此，骨礦含量(Bone mineral content，BMC)、骨密度(Bone mineral density，BMD)等常成為人們造模的必選指標之一。這些指標除了運用DXA骨密度儀，也可選用采用單光子(SPA)、雙光子吸收法(DPA)和定量CT(pQCT)等技術(shù)，評估體內(nèi)BMC和BMD。采用影像學方法最大的優(yōu)點是無損傷性。其中SPA較簡便價廉，不能檢測中軸骨[18]，通常用于橈骨（非優(yōu)勢臂）、跟骨、掌骨或指骨測定；而DXA分辨好，可以排除軟組織的干擾，提高了靈敏度與精確度；有條件也可運用CT三維重建技術(shù)對骨密度做更直觀的觀察。但由于體內(nèi)各部位的骨量丟失不盡一致[19]，在多部位檢測骨密度時應(yīng)注意造模時間對不同部位出現(xiàn)骨質(zhì)流失的影響。除了影像學方法，也可通過標本骨組織直接取材，進行脫鈣骨組織病理學檢查，該方法可以從組織學的角度發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)的受損。也可行熒光標記后，染色切片觀察，其中較為常用的反映骨組織形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)有代表骨量的骨小梁面積百分數(shù)(%Tb.Ar)、反映骨結(jié)構(gòu)參數(shù)的骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)等；反映骨轉(zhuǎn)換的動態(tài)指標包括反映骨形成活力的熒光標記周長百分數(shù)（L.Pm%）、骨礦化沉積率(MAR)、單位長度骨小梁表面上骨形成率(BFRPBS)、單位骨小梁面積骨形成率(BFRPBV)以及反映骨吸收活躍程度的單位骨小梁面積上破骨細胞數(shù)量(Oc1N)、單位骨小梁面積上破骨細胞周長百分數(shù)(%Oc1Pm)[16]。有條件運用掃描電鏡更能發(fā)現(xiàn)骨小梁密集程度、小梁間距、膠原數(shù)量、皮質(zhì)區(qū)鈣鹽沉積、鈣鹽顆粒密集度等的變化[17]。而且病理切片快捷、經(jīng)濟，測量結(jié)果與DEXA數(shù)據(jù)有高度相關(guān)性，與骨生物力學功能改變吻合良好，在骨質(zhì)疏松模型及藥效評價中具有一定的應(yīng)用價值[5]。

4.3 骨代謝的常用生化指標除了較常用的血鈣尿鈣、血磷尿磷和尿肌酐外，還包括成骨功能的指標和反映骨吸收功能的指標。骨形成標志物有：血清骨堿性磷酸酶(ALP)、骨堿性磷酸酶（BAP）、血清骨鈣素(BGP)、血清I型前膠原氨基末端肽N-端(PINP)、血清I型前膠原氨基末端肽C-端(PICP)等。骨吸收生化標志物有：血抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）、Ⅰ型膠原羧基交聯(lián)肽C-端(CTX-Ⅰ)、尿脫氧吡啶啉(DPD)、血清I型膠原交聯(lián)氨基末端肽N-端(NTX)、羥脯氨酸(Hyp)等。其中，BGP是由成骨細胞合成和分泌入血的，血清中的OC水平與骨組織中的水平呈正相關(guān)，可直接反映成骨細胞的活性和骨生理代謝變化[20]。而CTX在骨質(zhì)疏松治療前后變化率較大，而長期個體內(nèi)變異又較小，穩(wěn)定而又靈敏，可以作為評判治療效果的首選指標[5]。由于骨轉(zhuǎn)換生化指標的變化較病理變化早，一般在術(shù)后1～2.5個月就有明顯變化，因此骨轉(zhuǎn)換生化指標可以作為反映絕經(jīng)后早期骨量丟失的靈敏指標[21]，有助于造模的預測性診斷。

4.4 骨生物力學的常用指標常用的骨生物力學指標的檢測包括常規(guī)的骨長度、直徑和厚度等，還有骨彈性極限載荷、斷裂載荷和剛度等指標[22]。而長骨干中段三點彎曲力學試驗也越來越多地被運用，該試驗反映骨結(jié)構(gòu)力學指標主要有最大載荷、最大橈度、扭力矩、彈性載荷、彈性橈度及能量吸收等。這些檢測反映骨生物力學強度的變化，可以輔助評價發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的風險。

5 小結(jié)

建立骨質(zhì)疏松動物模型在研究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制、探討防治措施和新藥研究中均占有十分重要的地位，而去勢雌性大鼠動物模型作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物實驗經(jīng)典的研究材料，已被大多數(shù)學者所接受并廣泛運用。本文就近年去勢雌性大鼠的制模方法、月齡選擇及檢測指標作一綜述。值得關(guān)注的是我們對理想模型的要求是它的病變過程、病理改變及演變轉(zhuǎn)歸盡可能與人類骨質(zhì)疏松癥的變化相似，但不可否認大鼠承載應(yīng)力與人類不同，骨骼生長狀況也因此與人類不盡相同。并且受體型的限制，血量少，不能多次取骨活檢標本和大量采血標本，而且藥代動力學也與人類不同。受上述各種限制，大鼠去勢模型只可作為藥物效果的初步研究和OP的病理機制的初步探索，如果要做進一步藥物療效的研究和模擬人類OP的探索，還需在其他種類的動物模型上探討。

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R-332

A

1003—6350（2013）03—0424—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.03.0187

2012-09-11）

廣東省科技計劃項目（編號：2010B031600288）

王鍵。E-mail：wangjian1911@126.com