蝦類免疫因子的研究進展

■郭 慧 冼健安 畢建柱 葉超霞 王安利

（華南師范大學生命科學學院，廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室，生態(tài)與環(huán)境科學廣東普通高校重點實驗室，廣東廣州510631）

蝦類蛋白質豐富、營養(yǎng)價值高且具有很高的經(jīng)濟價值，蝦類養(yǎng)殖業(yè)從20世紀中葉就在全球廣泛興起，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有極為重要的地位，尤其是近年來特種水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的興起，使蝦類的身價倍增。據(jù)聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織統(tǒng)計，全世界海水和微咸水養(yǎng)殖的對蝦產(chǎn)量從1970年的8 987公噸增加到2006年的3 146 918公噸。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和水域生態(tài)環(huán)境的惡化，導致了各種各樣對蝦疾病的暴發(fā)，據(jù)估計，20世紀90年代以來，疾病給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失高達10億美元。

由于蝦類疾病帶來巨大經(jīng)濟損失，蝦類免疫學研究成為近年來研究的熱點，研究結果為蝦類的病害防治提供了堅實的理論基礎，為蝦類養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展提供了保障。隨著EST技術、基因芯片雜交、SSH和蛋白質組學在蝦類免疫學研究中的應用，越來越多的免疫因子被發(fā)現(xiàn)，這些免疫因子協(xié)同作用在蝦類免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。本文對蝦類免疫系統(tǒng)中重要的免疫因子進行綜述，以期為更深入的研究和應用提供參考。

1 蝦類的免疫系統(tǒng)

無脊椎動物（包括甲殼類動物）的先天免疫系統(tǒng)分為細胞免疫和體液免疫。細胞免疫是指對蝦通過血細胞將外界抗原物質吞噬、包裹、溶解、排出，達到清除異物的目的。體液免疫是通過體液免疫因子實現(xiàn)對抗原的識別、凝集、溶解、或者直接把病原微生物殺死。兩種免疫之間既有各自獨特的作用，又可以相互配合，共同發(fā)揮免疫效應。免疫反應的過程主要包括免疫識別、信號傳導以及免疫效應物質介導的效應反應。

一般認為，甲殼動物的免疫主要為非特異性免疫，其體液不具有免疫球蛋白，體液免疫主要是依靠血淋巴中的一些非特異性的酶或因子來進行的，這些因子包括抗菌肽、溶菌酶、凝集素等。還有一些免疫因子不能直接對抗原起作用，而是通過調節(jié)和誘導免疫反應，如酚氧化酶原級聯(lián)反應（prophenoloxidase cascade，proPO）、凝結反應（clot?ting cascade）和炎癥反應，或是通過調節(jié)細胞的狀態(tài)，起到防御的作用，這些防御因子包括絲氨酸蛋白及其抑制劑、熱休克蛋白、硫氧還蛋白、與細胞凋亡的蛋白等。根據(jù)EST技術、基因芯片雜交、SSH和蛋白質組學分析的研究結果，參與免疫識別的幾類基因，主要集中在體液免疫反應和細胞免疫反應。因此，對蝦免疫機制的研究主要集中在這些免疫相關因子及相關的反應上。

2 蝦類的免疫因子

2.1 凝集素

凝集素（lectin）是一類能結合糖的蛋白，在蛋白質轉運、細胞信號傳導、病原體識別和作為效應器分子等生物過程中扮演重要的角色。其最大的特點是能專一地、非共價地識別糖蛋白或糖脂的末端糖殘基，如脂多糖、肽聚糖、β-1,3-葡聚糖、甘露聚糖、脂磷壁酸等，因此，凝集素是模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)的主要參與者，它們的作用與脊椎動物的補體類似。在甲殼動物中，凝集素被視為一個在免疫識別和吞噬過程中有調理作用的潛在分子。凝集素按分子結構可分為C型凝集素、S型凝集素、P型凝集素、I型凝集素和Pentraxins。據(jù)報道，在大多數(shù)對蝦品種中都有不同C型凝集素的存在。從中國對蝦血細胞中克隆出的C型凝集素FcLectin，cDNA全長為1 482 bp，包括一個861 bp的開放閱讀框，編碼287氨基酸，含有兩個糖識別域（carbohydrate rec?ognition domain，CRD）。在受到細菌、脂多糖或WSSV刺激后其轉錄表達發(fā)生明顯的變化。隨后又從中國對蝦肝臟中分離出了5種C型凝集素，分別是FC-HSL、FC-LEC2、FC-Lec3、FC-Lec4、FCLec5。其中FC-HSL的cDNA全長為571 bp，含有一個480 bp的開放閱讀框，可編碼一個由159個氨基酸殘基組成的蛋白質。細菌或病毒感染后，F(xiàn)C-HSL的表達明顯上調。最近從克氏原螯蝦肝臟中分離出了一種C型凝集素PCLT，在感染溶藻弧菌和WSSV后，PCLT的表達明顯上調。同時，該研究結果表明，PCLT不僅是模式識別受體（PRR），而且還充當免疫調節(jié)因子，能通過調節(jié)血淋巴液中的細胞黏附蛋白、酚氧化酶、超氧化物歧化酶等免疫因子，以激活該基因并使其表達量上調來參與宿主防御異物的免疫反應。越來越多的實驗證明，凝集素不僅在對蝦先天免疫防御中扮演重要的角色，而且在其他的非特異性免疫反應中充當調節(jié)因子，調節(jié)其他免疫因子活性，共同對機體執(zhí)行不同的免疫防御作用。

此外，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）中，都有C型凝集素的研究。

2.2 脂多糖與β-1,3-葡聚糖結合蛋白

脂多糖與β-1,3-葡聚糖結合蛋白（Lipopoly?saccharide and β-1,3-glucan binding protein，LG?BP）是一種多功能的血漿因子，它能夠識別革蘭氏陰性菌的細胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和真菌的細胞壁成分β-1,3-葡聚糖（β-1,3-glucan，βG）。LGBP作為一種模式識別受體，在甲殼類動物的先天免疫中發(fā)揮重要作用。目前，已從南美白對蝦（Penaeus stylirostris）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）、凡納濱對蝦中分離出該蛋白。凡納濱對蝦的LGBP上發(fā)現(xiàn)具有細胞黏附肽RGD（Arg-Gly-Asp）、β-(1-3)多糖鍵識別位點，同時還有2個膜整合蛋白（integrin）結合域。當對蝦被細菌感染時，LGBP的表達水平顯著上升，表明LGBP在細菌病原體的識別過程中扮演重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對蝦的LGBP（PmLGBP）作為一種模式識別受體，參與蝦類的酚氧化酶原系統(tǒng)，它識別結合病原體的脂多糖和β-1,3-葡聚糖后激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)（Prophenoloxidase-activat?ed system，proPO-AS），以此防御病原體的感染。實驗表明，重組PmLGBP（rPmLGBP）在脂多糖或β-1,3-葡聚糖存在下可提高血細胞懸液中的酚氧化酶（PO）的活性。

2.3 Toll樣受體

Toll樣受體（TLRs，Toll like receptors）能特異識別病原相關分子模式（PAMP），是一類在先天免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮重要作用的蛋白質。Toll樣受體家族是進化中比較保守的一類免疫識別受體，在對抗病原微生物感染、引發(fā)免疫和炎癥反應中發(fā)揮著重要作用。目前已確認的Toll樣受體家族成員至少有13種，分別命名為TLR1～TLR13。在對蝦中，也分離出了幾類Toll樣受體。第一個Toll樣受體是從凡納濱對蝦中分離出來的LvToll，它編碼了926個氨基酸殘基，包含了Toll受體家族的特征區(qū)域，即富含16個亮氨酸的重復序列的胞外區(qū)和含有保守TIR的結構域（Toll-Interleukin-1 receptor domain）。凡納濱對蝦Toll樣受體中結構域第1～125和34～158個位點的氨基酸序列與斑節(jié)對蝦、赤擬谷盜和果蠅TIR基因序列有較高的相似性。說明無脊椎動物對抗病原體的先天免疫機制與脊椎動物具有相似性且起源一致。中國對蝦中克隆出來的Toll樣受體FcToll編碼931個氨基酸殘基，包含5個外顯子和4個內含子。FcToll在不同組織中都有表達，但主要表達在淋巴器官中，在細菌或病毒刺激后，F(xiàn)cToll的表達模式發(fā)生了明顯的變化。

2.4 四次跨膜蛋白

四次跨膜蛋白（Tetraspanin/TM4SF）是一種在真核有機體中廣泛表達的超家族成員。有研究指出，四次跨膜蛋白分子可能與幾種Ig家族的蛋白相聯(lián)系，在免疫反應中起作用。為了解四次跨膜蛋白在對蝦免疫系統(tǒng)中的作用，從中國對蝦中克隆出了四次跨膜蛋白家族的三種基因，分別是CD9、CD63和tetraspanin-3，它們具有四次跨膜蛋白特有的氨基酸序列。這三個基因均在對蝦不同的組織中表達，CD9（FcCD9）在肝中特異性表達，CD63（FcCD63）在神經(jīng)、表皮和心臟中表達量最高，而tetraspanin-3（FcTetraspanin-3）在腸道中的表達量和表達豐度都是最高的。當對蝦感染W(wǎng)SSV后，這三種基因在對蝦組織中的表達量均顯著上調。

2.5 溶菌酶

溶菌酶（Lysozyme）又稱胞壁質酶（Murami?dase），是一種廣泛存在于各種動物體內的一種堿性蛋白，是機體先天免疫系統(tǒng)中的一個重要免疫效應分子，能水解革蘭氏陽性細菌細胞壁黏性多肽中的乙酰氨基多糖，從而損傷細菌的細胞壁，最終使細胞崩解，從而實現(xiàn)機體的免疫防御。近年來，陸續(xù)從中國對蝦、日本對蝦、凡納濱對蝦等甲殼動物體內檢測到溶菌因子的存在。研究表明，正常中國對蝦的血淋巴中具有較強的溶菌活力，而瀕死中國對蝦血淋巴的溶菌活性基本喪失，因此，認為溶菌活力可作為檢測對蝦機體免疫功能狀態(tài)的一個有價值的參考指標。

2.6 酚氧化酶(PO)及酚氧化酶原激活系統(tǒng)

在無脊椎動物中，PO一般以無活性的酶原-酚氧化酶原proPO的形式存在，無活性的proPO在絲氨酸蛋白酶的作用下轉變成有活性的PO。酚氧化酶原激活系統(tǒng)(Prophenoloxidase-activated sys?tem，proPO-AS）是由proPO、PO、模式識別蛋白和多種絲氨酸蛋白酶及其抑制劑構成的一個復雜的級聯(lián)反應。這一過程類似于高等動物的補體激活途徑。

2.6.1 絲氨酸蛋白酶

絲氨酸蛋白酶(Serine protease，SP)是一種重要的蛋白水解酶，廣泛存在于動物、植物、微生物中。SP及其同源物參與無脊椎動物的先天免疫，包括淋巴凝血、細胞黏附、抗菌多肽和黑色素的合成。PRRs對病原體的識別可激活SP級聯(lián)反應。從中國對蝦中克隆出了一種絲氨酸蛋白酶（FcSP）和絲氨酸蛋白酶同源物（FcSPH）。FcSP主要分布在血細胞中，而FcSPH蛋白在鰓和胃中有表達。FcSP蛋白在正常的蝦體中會有局部裂解，而Fc?SPH蛋白是在對蝦感染鰻弧菌后才會裂解。表明絲氨酸蛋白酶和其同源物可能參與絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應，并在對蝦的先天免疫中發(fā)揮重要作用。

2.6.2 絲氨酸蛋白酶抑制劑

絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpin，SPI）與SP一起參與蛋白酶級聯(lián)反應，proPO-AS由SP級聯(lián)反應介導的，而SPI在調節(jié)SP活力方面發(fā)揮了重要作用，因此，整個proPO-AS是由SPI調控的。從中國對蝦的血細胞中克隆出的SPI（FC-serpin）RT-PCR檢測表明，F(xiàn)C-serpin主要在血細胞和淋巴器官中表達。細菌和病毒感染后，F(xiàn)C-serpin的表達量大幅度變化。表明FC-serpin可能在對蝦先天免疫中發(fā)揮潛在的作用。

2.6.3 proPO

proPO是一個黑色素合成酶，是節(jié)肢動物中一個重要的免疫蛋白。甲殼動物血細胞內的proPO能夠被一些蛋白或微生物多糖激活(如LPS、βG或PG)，而轉變成有活性的酚氧化酶(PO)。截止目前，在螯蝦、凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦中都有關于proPO的報道。用RACE技術從中國對蝦血細胞中克隆出了proPO基因，研究表明，proPO在血細胞、淋巴器官和肝中都有表達，且血細胞中ProPO基因的表達水平最高。感染鰻弧菌后，proPO在血細胞中的mRNA表達水平明顯上調，說明proPO在對蝦的免疫系統(tǒng)中扮演重要的角色。

2.7 抗菌肽

抗菌肽(AMPs)是生物體產(chǎn)生的一類小分子多肽，對真菌、細菌等病原微生物具有抑制或殺滅作用，通常被稱為“第二防御體系”。相關研究結果表明，當細菌、真菌或者病毒病原體侵染機體后，甲殼類動物通過相關的信號傳導系統(tǒng)激活先天免疫系統(tǒng)中的體液免疫反應，然后導致相關抗菌肽分子以及抗病毒因子的上調表達，來對抗病原體的侵染。1997年，首次從凡納濱對蝦血細胞和血漿中分離出幾種抗菌肽，測定其中三種氨基酸序列，首次報道了甲殼動物抗菌肽的氨基酸全序列。此后，由于抗菌肽具有殺滅病毒和細菌的功能，越來越受到重視，并有望應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。截止目前，在蝦類中已有多種關于抗菌肽或蛋白質的報道。研究發(fā)現(xiàn)，藍蝦的抗菌物質由顆粒細胞產(chǎn)生，在注射外源微生物后的12 h內，顆粒細胞轉移到病灶處,經(jīng)脫顆粒和隨后的細胞裂解釋放大量抗菌物質，在凡納濱對蝦中也發(fā)現(xiàn)了類似的情況。已確定對蝦抗菌肽3（CH-penaeidin）的cD?NA全長能編碼71個氨基酸殘基，主要在血細胞中表達。重組的CH-penaeidin在畢赤酵母中表達。在感染某些革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌時，它表現(xiàn)出活性，但在感染真菌時表現(xiàn)出相對較低的活性。

2.8 血藍蛋白

血藍蛋白（Hemocyanin）是一種多亞基的蛋白復合體，是節(jié)肢動物和軟體動物血淋巴的重要組成部分，占甲殼動物血清總蛋白的60%～90%，最新的研究發(fā)現(xiàn)，它不但作為氧氣載體為動物提供充足的氧，還具有防御病原體的功能，說明血藍蛋白是一種相當重要的潛在免疫分子。研究發(fā)現(xiàn)，南美白對蝦的血藍蛋白與凝集素都具有凝集功能，可使魚、雞、鼠和人的紅細胞以及8種蝦類病原菌發(fā)生凝集作用，但其凝集活性比一般的凝集素要低。同時還發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦的血藍蛋白的C端存在一個Ig樣保守結構域，該結構域與人Ig具有高度同源性，而且空間結構也相似，從而證明血藍蛋白也是免疫球蛋白超家族(immunoglobulin su?perfamily，IgSF）成員之一。由此說明，血藍蛋白在對蝦的先天免疫中可能發(fā)揮重要作用，為對蝦血藍蛋白免疫因子基礎的闡明提供科學依據(jù)。此外，血藍蛋白裂解產(chǎn)生的一些抗菌肽和酚氧化酶血藍蛋白裂解產(chǎn)生的抗微生物肽也與免疫反應有關。凡納濱對蝦體內注射哈維氏弧菌后，血淋巴和肝臟中血藍蛋白mRNA表達量上調，說明病原體感染對蝦后啟動機體合成血藍蛋白，新合成的血藍蛋白主要執(zhí)行酚氧化酶等免疫功能，與其它免疫因子協(xié)同作用參與機體的免疫反應。從日本對蝦血淋巴中分離出的血藍蛋白復合物可延遲WSSV的感染，這不僅說明血藍蛋白在抵御病原體時發(fā)揮了重要作用，同時也表明血藍蛋白的兩種亞基PjHcL和PjHcY可能在對蝦先天免疫系統(tǒng)中有不同的功能。

2.9 伴侶蛋白

熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）是熱休克蛋白家族中最重要的一類家族成員，它參與了多種生物免疫應答過程，而且在許多疾病治療上有很大的潛力。在中國對蝦中克隆出了一種HSP70家族的成員GRP78（命名為FcGRP78），當對蝦受到WSSV病毒感染后，該蛋白在血細胞、肝胰臟和淋巴器官中有差異表達，說明FcGRP78作為一種伴侶蛋白，可能在蛋白質折疊和對蝦的免疫功能中扮演重要的角色。目前，在克氏原鰲蝦(Procambarus Clarkii)、日本對蝦、中國對蝦等蝦類中都有關于熱休克蛋白的報道。

2.10 抗氧化酶系統(tǒng)

抗氧化酶是無脊椎動物機體非特異性免疫的一個重要方面。超氧化物歧化酶（Superoxide dis?mutase，SOD）是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應轉化為O2和H2O2的酶。超氧化物歧化酶是抗氧化系統(tǒng)中起關鍵作用的酶，不僅具有清除體內自由基的作用，而且在機體免疫調節(jié)中具有重要的作用。它一般需要金屬離子作為共同反應因子來進行歧化反應。有報道表明，甲殼動物除了利用血藍蛋白作為主要的氧氣輸送中心外，還有一種錳超氧化物歧化酶（MnSOD）。過氧化氫酶（cat?alase，CAT）廣泛存在于各類生物體中，其酶促活性為機體提供了抗氧化防御機理，其主要作用是消除過多的過氧化氫和維持細胞正常的氧化還原平衡。目前，已經(jīng)在對蝦中克隆出了過氧化氫酶的序列并對其抗氧化功能進行了研究。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）是機體內廣泛存在的過氧化物分解酶，可催化谷胱甘肽（GSH）參與過氧化反應，清除細胞內的過氧化物和羥自由基。它的表達上調跟環(huán)境污染物直接相關，因此被作為一種重要的生物標記。Liu等從凡納濱對蝦中克隆了GPx基因，并發(fā)現(xiàn)其在受到細菌感染后基因表達有所上調。另外，中國對蝦中也有GPx的報道。Wang等對pH值應激下凡納濱對蝦血淋巴中MnSOD、CAT、GPx的基因表達進行研究，結果表明，酸性或堿性誘導可導致DNA損傷并激活Mn?SOD、CAT、GPx的基因表達。

2.11 抗脂多糖因子

抗脂多糖因子（Antilipopolysaccharide factor，ALF）是一個小的堿性蛋白，最初是在鱟的阿米巴狀細胞中分離出來的。它結合脂多糖并中和由脂多糖誘導的鱟阿米巴狀細胞溶解物的凝膠化。2005年，從中國對蝦血細胞中克隆出了一個抗脂多糖因子家族的抗菌蛋白基因（暫命名為ALFFc）。ALF的cD?NA全長為600 bp，其中包含有一個369 bp的開放閱讀框，能編碼123個氨基酸。ALFFc主要在血細胞中表達，當對蝦在感染弧菌后，ALF轉錄水平的表達明顯上調。這為了解ALFFc在對蝦先天免疫中的功能提供了理論基礎。

2.12 QM蛋白

QM蛋白是一個轉錄輔助因子，可抑制AP-1轉錄因子的活性，也是參與蛋白質合成的核糖體蛋白。利用抑制性消減雜交（suppression subtrac?tive hybridization，SSH）技術從日本囊對蝦中獲得了一段與QM同源性較高的基因片段，用RACE技術獲得了QM基因全長cDNA序列，將其命名為PjQM。該基因包含一個長度為663 bp的開放閱讀框，預測編碼221個氨基酸。當對蝦受WSSV病毒感染4 h后，PjQM的轉錄即出現(xiàn)上調表達，在感染72 h后其表達水平約為正常對蝦的150%，說明對蝦QM基因參與了對蝦的抗病毒免疫過程。當感染細菌和病毒后，日本對蝦和皺紋盤鮑鰓中的QM基因也出現(xiàn)上調表達。這表明QM蛋白通過參與無脊椎動物的酚氧化酶原激活系統(tǒng)，以此防御細菌和病毒的感染。

2.13 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotin?amide adenine dinucleotide phosphate(NADPH)ox?idases，Noxes）是一種能催化氧氣和NADPH生成超氧化物的酶，具有復雜的結構。利用RACE技術從日本囊對蝦中獲得Nox基因的cDNA全長為4 216 bp（命名為MjNox），是第一個從甲殼類動物鑒定和克隆得到的NOX家族成員。當健康對蝦受到弧菌或聚乙烯刺激后，MjNox在淋巴器官、肝和血細胞中高效表達，并在刺激4 h后達到最高表達量，12 h后下降到正常水平。這表明MjNox可能在細胞增殖、炎癥反應和免疫保護反應中具有一定功能。

3 展望

蝦類的免疫系統(tǒng)是由血細胞和其產(chǎn)生的免疫因子組成的一個高度復雜的網(wǎng)絡。目前，絕大多數(shù)的工作都集中在克隆一些重要基因以及分子水平上的表達和功能的研究。免疫穩(wěn)態(tài)是對蝦先天免疫系統(tǒng)中維持不同免疫途徑的平衡必不可少的，目前我們對免疫穩(wěn)態(tài)的相關知識還知之甚少，與體液免疫反應相比，對蝦的細胞免疫反應的研究也十分有限，因此有關蝦免疫學的知識還不是很健全。隨著分子生物學技術，如SSH、EST、蛋白質組學在對蝦免疫學中的應用，更多未知的免疫相關因子將被發(fā)現(xiàn)，隨著這些免疫因子功能的進一步挖掘，蝦類免疫系統(tǒng)將逐步被探明，為蝦類的病害防治提供理論基礎，促進蝦類養(yǎng)殖的健康持續(xù)發(fā)展。

（參考文獻73篇，刊略，需者可函索）