慢性淋巴細(xì)胞白血病的臨床免疫表型分析

張青艷，陳智超，趙阿蘭，吳耀輝

(華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢430022)

慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)是一種單克隆性小淋巴細(xì)胞疾病，細(xì)胞以正常或高于正常的速率復(fù)制增殖，大量積聚在骨髓、血液、淋巴結(jié)和其他器官，最終導(dǎo)致正常造血功能衰竭的低度惡性疾病。這類細(xì)胞形態(tài)上類似成熟淋巴細(xì)胞，但是一種免疫學(xué)不成熟的、功能不全的細(xì)胞。CLL絕大多數(shù)起源于B細(xì)胞，T細(xì)胞者較少［1］。免疫分型可以證明CLL淋巴細(xì)胞的單克隆性，B-CLL 主要表達(dá) CD5、CD19、CD20，SmIg、FMC7弱表達(dá)。T-CLL主要表達(dá)成熟T淋巴細(xì)胞標(biāo)記，如 CD2、CD3、CD8或 CD4陽(yáng)性，CD5陰性。2010年7月～2012年1月，我們應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)26例B-CLL患者外周血或骨髓標(biāo)本白血病細(xì)胞的免疫表型進(jìn)行了測(cè)定?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 26例B-CLL患者，男17例，女9例;中位年齡62.5(40～76)歲。均符合2007年第3版張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。其中貧血伴乏力、納差6例，反復(fù)低熱、體力下降6例，淋巴結(jié)腫大5例，進(jìn)行性消瘦3例，脾大伴腹脹2例，出血2例，體檢示血象異常1例，皮膚黃染1例。

1.2 免疫表型測(cè)定方法 抽取并肝素抗凝骨髓或外周血3 mL(6 h內(nèi))，常規(guī)溶血，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整后溶于PBS中。利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針，選用CD56、CD22、CD11c、HLA-DR、CD20、CD79a、CD25、sIgD、CD43、CD123、CD4、CD7、CD30、CD8、CD3、CD+4等 27種胞膜抗體，所有抗體均為Becton Dickinson公司產(chǎn)品，每管中含該樣品100 μL(約2×105細(xì)胞/mL)，加入 20 μL CD45-PerCP、20 μL CD33-PE 及 1.5 μL的FLAER，混勻后置于室溫避光孵育20min，PBS洗滌，PBS重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每管收集20 000個(gè)細(xì)胞，在CD45/SSC點(diǎn)圖上設(shè)門分析各群細(xì)胞占有核細(xì)胞比例。以熒光陽(yáng)性細(xì)胞＞20%為相應(yīng)抗原陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

26例患者的外周血和骨髓標(biāo)本免疫表型測(cè)定結(jié)果大體一致。B-CLL患者抗原的表達(dá)在各類檢測(cè)的抗原中，CD19、CD20、HLA-DR 陽(yáng)性表達(dá)率最高，均為100%，CD19(平均陽(yáng)性率82.65%)從祖B細(xì)胞階段開始表達(dá)，直至漿細(xì)胞前階段，CD20(平均陽(yáng)性率79.20%)表達(dá)于早期B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞階段，CD5和 CD19雙陽(yáng)性病例占 53.85%，cCD79a為96.15%，CD5為 84.62%，CD23為 84.62%，CD11c為84.62%，CD22為 65.38%，CD24為 61.54%，CD38為42.31%，CD43為 19.23%，CD25為15.38%，CD2為3.85%，CD56為0.00。26例患者中平均62.26%的B-CLL表達(dá)cCD79a，而CD79a主要表達(dá)于除漿細(xì)胞外B細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段，是B細(xì)胞的特征性標(biāo)記;65.68%B-CLL 表達(dá) CD5，58.75%B-CLL 表達(dá) CD23，48.04%B-CLL 表達(dá) CD11c，而 HLA-DR、CD19、CD20、CD24平均陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.25%、82.65%、79.20%、63.37%，其中 HLA-DR、CD19的平均陽(yáng)性表達(dá)率最高，而CD56陽(yáng)性率最低為2.22%。

3 討論

B-CLL是起源于B淋巴細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和克隆化的惡性疾病，在歐美為發(fā)病率最高的白血病，占總白血病的30%左右，而在亞洲國(guó)家相對(duì)少見，根據(jù)中國(guó)血液病研究所20世紀(jì)80年代的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，BCLL占慢性白血病的6%，近年來(lái)隨著檢測(cè)手段的進(jìn)步其患病率呈上升趨勢(shì)［2］。B-CLL在各年齡組均可發(fā)病，以中年多見，中位發(fā)病年齡為53歲，男性多于女性［1］，罕見小于30歲的病例。本組26例患者中位發(fā)病年齡為62.5歲，其中≥60歲者14例，與文獻(xiàn)報(bào)道相似。

近年來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)由于能快速、多參數(shù)、客觀地測(cè)定細(xì)胞抗原表達(dá)而廣泛應(yīng)用于各種臨床疾病的診斷及輔助檢測(cè)，尤其在惡性血液病的診斷檢測(cè)中應(yīng)用普遍［3］。采用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)B-CLL能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行免疫分型，提供診斷依據(jù)。B-CLL患者外周血中積累了大量單克隆淋巴細(xì)胞，主要表型特點(diǎn)為CD5與CD19共陽(yáng)性。本研究26例B-CLL患者中，CD19均高表達(dá)，細(xì)胞平均陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)82.65%;同時(shí)CD20為100%表達(dá)，細(xì)胞平均陽(yáng)性表達(dá)率79.20%，而CD20在正常B淋巴細(xì)胞激活后會(huì)逐漸丟失;CD22陽(yáng)性率達(dá)65.38%，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，早期B淋巴細(xì)胞亦表達(dá)CD22［4］，以上三點(diǎn)均提示這類細(xì)胞是免疫學(xué)不成熟、功能不全的細(xì)胞。本研究中有22例(84.62%)為 CD5陽(yáng)性，26例(100%)為CD19陽(yáng)性，CD+5CD+19平均陽(yáng)性率56.17%，因此同時(shí)測(cè)定CD5和CD19對(duì)B-CLL的診斷有重要意義，此結(jié)論與國(guó)內(nèi)其他文獻(xiàn)相一致［5，6］。

本研究26例診斷為B-CLL患者的淋巴細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)CD2(3.85%)、CD3(7.69%)、CD4(0.00)、CD8(0.00)均比正常人極度減低，即使排除他們的淋巴細(xì)胞比例增高的原因，他們的細(xì)胞免疫功能仍然顯著低于正常人，同時(shí)提示部分細(xì)胞可伴系表達(dá)［7］。目前大部分研究認(rèn)為，CD38表達(dá)與CLL預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［8］，CD38是一種能夠促使B細(xì)胞活化和增殖的Ⅱ類跨膜糖蛋白，還是疾病侵襲性的一個(gè)重要指標(biāo)，無(wú)論患者的臨床分期如何，即使處于Rai分期的0期，CD38+患者亦常具有明顯的侵襲性，因此，CD38+的表達(dá)是CLL重要的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)［9］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，B-CLL臨床預(yù)后差異大，而且預(yù)后相關(guān)因素較多［10］，CD38是B-CLL預(yù)后的眾多相關(guān)因素之一。本組26例CLL患者中有11例患者表達(dá)CD38，但由于病例數(shù)較少，有待進(jìn)一步積累病例進(jìn)行研究。

目前臨床多進(jìn)行CD45設(shè)門分析各群細(xì)胞占有核細(xì)胞比例，由此我們可考慮從中再選取CD+5CD+19細(xì)胞再設(shè)門分析，以提高惡性細(xì)胞抗原表達(dá)率，由此提高疾病診斷率。而這在緩解后白血病患者復(fù)發(fā)診斷中尤其重要，同時(shí)測(cè)定CD38在一定程度上可提示預(yù)后;T淋巴細(xì)胞亞群各項(xiàng)指標(biāo)均極度減低是首診B-CLL的另一特點(diǎn)，在治療過(guò)程中隨時(shí)監(jiān)測(cè)病情變化并為我們及時(shí)提供患者免疫功能狀態(tài)，有助于診療及預(yù)后。自體細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)治療白血病成為近年研究熱點(diǎn)，但與體外的高抗瘤活性相比，體內(nèi)療效遠(yuǎn)未達(dá)到人們的預(yù)期。如何提高CIK在體內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞效果是研究的熱點(diǎn)與關(guān)鍵所在，通過(guò)監(jiān)測(cè)CIK培養(yǎng)前后免疫表型的變化可以對(duì)腫瘤的過(guò)繼免疫治療提供新的思路。

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