應用ELISA檢測我國豬病的研究進展

方禮祿，王朝軍，徐 利，沈 君，虞桂平，嚴彩虹，楊 光

（1.北京市SPF豬育種管理中心，北京 100194；2.北京市養(yǎng)豬育種中心，北京 100194）

ELISA可測定抗原，也可測定抗體。固相的抗體（抗原）、酶標記的抗體（抗原）和酶作用的底物，這3種試劑缺一不可。按照試劑的來源、標本的性狀及檢測的條件，可將ELISA技術分為間接法測抗體、雙位點一步法、雙抗體夾心法、捕獲法、競爭法、應用親和素和生物素的ELISA[1]。

1 ELISA的原理

ELISA的基礎是抗體（抗原）的固相化及抗體（抗原）的酶標記，基本原理為抗體（抗原）吸附在固相載體的外表面，且要維持抗體（抗原）的免疫活性；抗體（抗原）能通過共價鍵來與酶連接而形成酶復合物，這種酶復合物的免疫學和酶學活性都沒有發(fā)生改變；酶復合物與對應的抗體（抗原）結合后，可依據(jù)加入底物后的顏色變化來判定是否有免疫反應，并且顏色變化的深淺與試驗中相應抗體（抗原）的量成正相關，因此可以依據(jù)底物顯色的深淺程度來判定試驗結果。ELISA是一種敏感度極高且特異極強的試驗方法，與傳統(tǒng)分析方法相比，敏感度更高、特異性更強、準確度更高、操作更簡單方便、更經(jīng)濟實惠。

2 ELISA技術在豬病檢測中的應用

豬病給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，直接打擊養(yǎng)殖戶的積極性，致使我國養(yǎng)豬業(yè)不能健康快速發(fā)展。只有對豬疾病做到正確診斷，才能給養(yǎng)豬業(yè)減少經(jīng)濟損失，從而促進養(yǎng)豬行業(yè)的發(fā)展。目前ELISA已被廣泛應用于畜牧業(yè)的動物飼料農(nóng)藥殘留測定、動物疾病診斷、畜產(chǎn)品安全檢測、環(huán)境污染控制等領域。

2.1 豬病毒性傳染病的診斷

2.1.1 豬繁殖與呼吸障礙綜合征

建立檢測豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）抗體的間接ELISA所用的包被抗原有PRRSV的N重組蛋白、GST-GP5-M重組融合蛋白、ORF5重組蛋白、GP5重組膜蛋白及PRRSV[2-5]。PRRSV的N重組蛋白ELISA與IDEXX公司ELISA試劑盒的檢測結果符合率是91%，與IDEXX-ELISA的檢測陽性符合率為92.7%；PRRSV的GST-GP5-M重組融合蛋白ELISA與IDEXX-ELISA的檢測結果符合率為94.1%；PRRSV的ORF5重組蛋白ELISA與海博萊試劑盒的檢測結果符合率為100%；以膜蛋白為包被抗原的ELISA陽性率的降幅度顯著高于以核衣殼蛋白為包被抗原的ELISA[2-5]。孫淑芳等采用抗PRRS N蛋白單克隆抗體建立檢測PRRSV抗體競爭性ELISA，其敏感性高、特異性好，與IDEXX的PRRSV ELISA的檢測結果符合率＞90%[6]。

2.1.2 豬偽狂犬病毒

建立檢測豬偽狂犬病毒（PRV）抗體的間接ELISA所用的包被抗原包括PRV、PRV的gE630重組蛋白及gB重組蛋白[7-9]。祁小樂等建立了一套具有特異性強、敏感性高、方便可靠和簡單快捷的檢測PRV的單克隆抗體雙夾心ELISA，為PRV的快速診斷奠定了基礎[10]。汪招雄等把PRV Ea株特異性單克隆抗體576株作為捕獲抗體、把已純化的抗PRV IgG作為檢測抗體，成功建立了一種可廣泛應用于動物組織中PRV檢測的雙抗體夾心ELISA，比PCR檢測方法敏感[11]。其中PRV ELISA與美國ELISA陰、陽性的檢測結果完全符合，PRV gE630重組蛋白ELI?SA與進口診斷試劑盒的檢測符合率高達96.3%，PRV重組gB蛋白ELISA與IDEXX PRV gB ELISA試劑盒的檢測結果符合率為79%[8-9]。

2.1.3 豬瘟

馮朝興成功建立了一種能聯(lián)合檢測豬瘟（CSF）、豬鏈球菌和豬巴氏桿菌抗體的Dot-PPAELISA[12]。楊利峰等利用生物素標記的探針在鏈親和素包被的微量板孔中雜交捕獲地高辛標記的PCR產(chǎn)物并進行免疫顯色的原理建立了一種檢測CSF的RT-PCR ELISA[13]。魏巍等以CSF病毒囊膜糖重組蛋白E2為包被抗原建立的一種檢測CSF抗體的間接ELISA，其與法國LSI公司試劑盒的檢測符合率為83.6%，且敏感度不低于進口Idexx試劑盒[14]。

2.1.4 豬戊型肝炎病毒

建立的檢測豬戊型肝炎病毒（HEV）抗體的ELI?SA所用的包被抗原有HEV重組蛋白AG02、DQ1重組蛋白、ORF3重組蛋白、ORF2-C重組蛋白、ORF2-N重組蛋白及ORF3的一段序列合成肽swHEV11[15-17]。其中ORF2重組蛋白ELISA和swHEV11 ELISA與北京萬泰ELISA試劑盒的陽性符合率分別為91.5%和73.4%，ORF2-C ELISA的檢測效率顯著高于ORF2-N[18-19]。

2.1.5 口蹄疫病毒

朱彩珠等以口蹄疫病毒（FMDV）非結構重組蛋白3AB（FMDV-3AB）多肽為抗原建立的檢測FMD血清抗體的間接ELISA，其比VIAA-AGID法檢出率高，特異性也高于3ABC-I-ELISA[20]。王光華等以FMDV VP1重組結構蛋白為抗原建立的檢測豬FMD抗體的間接ELISA，其與液相阻斷ELISA的檢測結果符合率為96.25%，與HA的檢測結果符合率高達96.2%，與上海優(yōu)耐特FMDV VP1 ELISA檢測結果符合率為87.27%[21]。

2.1.6 豬日本乙型腦炎病毒

建立檢測豬日本乙型腦炎病毒（JEV）抗體的間接ELISA所用的包被抗原包括JEV、JEV囊膜E重組蛋白及JEV非結構重組蛋白NS1[22-24]。其中JEV囊膜重組E蛋白ELISA與康柏德豬乙腦ELISA的符合率為82%，JEV非結構重組蛋白NS1 ELISA與商品化試劑盒檢測結果的符合率為96.0%[22-24]。

2.1.7 其他

建立檢測豬2型圓環(huán)病毒（PCV2）抗體的ELISA所用的包被抗原有PCV2 ORF2重組蛋白及PCV2 Cap重組蛋白[25-27]。PCV2 Cap重組蛋白ELISA與國產(chǎn)商品化試劑盒檢測結果符合率為95.6%[26]。以豬傳染性胃腸炎病毒N重組蛋白為包被抗原建立的檢測豬傳染性胃腸炎病毒抗體檢測的間接ELISA，與Svanova TGEV/PRCV antibody diagnosis Kit的檢測結果符合率為87.0%[28]。建立檢測豬流感病毒抗體的間接ELISA所用的包被抗原有豬流感病毒、HI亞型豬流感HA1重組蛋白、HI亞型豬流感HA重組蛋白[29-31]。

2.2 豬細菌性傳染病的診斷

2.2.1 豬鏈球菌

歐瑜等以提取的豬鏈球菌2型分離株HA9801溶菌酶釋放蛋白（MRP）的抗體和胞外因子（EF）的抗體，分別建立了檢測豬鏈球菌的Dot-ELISA和間接ELISA[32]。建立檢測豬鏈球菌2型MRP抗體的間接ELISA所用的包被抗原包括豬鏈球菌2型重組MRP蛋白、豬鏈球菌2型分泌核酸酶基因（SsnA）重組蛋白、Sez與Ss2的全菌（WAC）、超聲波抗原（UA）及英膜多糖（CPS）作為抗原方法。其中CPSELISA方法具有較好的特異性、靈敏性、穩(wěn)定性及應用推廣價值[33-34]。

2.2.2 副豬嗜血桿菌

建立檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA所用的包被抗原包括：副豬嗜血桿菌、副豬嗜血桿菌的莢膜多糖（CPS）、副豬嗜血桿菌重組外膜蛋白P5及副豬嗜血桿菌重組外膜蛋白P2[35-38]。其中CPSELISA與間接血凝試驗（IHA）的符合率為65.3%，且敏感性比IHA-ELISA高500%～1 000%[36]。

2.2.3 豬源支氣管敗血波氏桿菌

趙戰(zhàn)勤等以豬源支氣管敗血波氏桿菌（Bb）的重組蛋白百日咳桿菌黏附素（PRN）為包被抗原，建立了一種檢測天然PRN抗體的間接ELISA[39]。何華等以豬源支氣管敗血波氏桿菌的菌毛fimD重組蛋白為包被抗原，建立了檢測豬源支氣管敗血波氏桿菌抗體的間接ELISA（fimD-ELISA）[40]。譚春萍以豬支氣管敗血波氏桿菌皮膚壞死毒素（DNTN）重組蛋白為抗原，建立了檢測DNT抗體的間接ELISA[41]。

2.2.4 豬胸膜肺炎放線桿菌

劉建杰等以純化的豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）毒素Ⅰ重組蛋白為包被抗原，建立了一種檢測毒素Ⅰ血清抗體的ELISA方法[42]。賈凡以純化的豬胸膜肺炎放線桿菌毒素ApxⅡ重組蛋白和毒素ApxIV重組蛋白為包被抗原，分別建立了兩種檢測豬胸膜肺炎放線桿菌血清中毒素ApxⅡ及ApxIV抗體的ELISA，其中pxIV-ELISA具有較高的特異性和敏感性，與CHEKIT-APP-APXIV試劑盒檢測結果的符合率為91.37%[43]。張志妮以豬胸膜肺炎放線桿菌毒素重組蛋白ApxⅣ疫BALB/c小鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/O進行融合，以重組蛋白ApxⅣ和表達宿主菌的菌體蛋白為檢測抗原，篩選出兩株分泌穩(wěn)定、為IgG且有不同的抗原結合表位的雜交瘤細胞：587、5C11，建立了一種檢測ApxⅣ毒素的雙抗體夾心ELISA[44]。杜軍等用胸膜肺炎放線桿菌血清2型（1536）菌液與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化后免疫大白兔，制備兔高免血清，再提純抗體，建立了一種檢測豬傳染性胸膜肺炎血清2型抗體的雙夾心ELISA[45]。

2.2.5 豬水腫毒素

趙戰(zhàn)勤等建立的一種檢測豬水腫毒素抗體的ELISA，是以純化的豬水腫毒素A亞基重組蛋白為包被抗原[46]。張建民等以豬水腫毒素A亞基重組蛋白作抗原免疫BALB/c小鼠制備單抗，并利用表達蛋白和豬水腫毒素A亞基單抗酶結合物，建立了一種檢測豬水腫毒素抗體的競爭性ELISA[47]。

2.2.5 豬附紅細胞體

韓惠瑛等用純化的豬附紅細胞體抗原免疫兔制備超免疫血清，以辣根過氧化物酶標記葡萄球菌A蛋白作為二抗，建立了一種檢測豬附紅細胞體的PPA-ELISA[48]。張守發(fā)等以純化的豬附紅細胞體抗原作為包被抗原，建立了一種檢測豬附紅細胞體抗體的Dot-ELISA[49]。

2.3 豬支原體性傳染病的診斷

逯曉敏等、陳杰、沈青春等、張長瑩等建立了檢測豬支原體的間接ELISA，所用的包被抗原包括豬肺炎支原體黏附因子P97R1重組蛋白、豬肺炎支原體膜蛋白、豬肺炎支原體重組P46膜蛋白及豬支原體MSG1重組蛋白質(zhì)[50-53]。張長瑩等以豬嗜血支原體重組MSG1蛋白和辣根過氧化酶標記的MSG1蛋白單抗建立了一種檢測豬嗜血支原體的阻斷ELISA[54]。劉星等用豬鼻支原體CVCC361免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術和酶聯(lián)免疫吸附試驗篩選出抗該病原體的單克隆抗體，并篩選出配對抗體，建立了一種檢測抗豬鼻支原體的雙抗體夾心ELISA[55]。陳杰等建立的檢測豬肺炎霉形體抗體的間接ELISA是以純化的豬肺炎霉形體ATCC25095株膜蛋白包被抗原的[56]。

2.4 豬衣原體性傳染病的診斷

梅仕林以純化的流產(chǎn)嗜性衣原體CP/12株種不同片段大小多型性的重組外膜蛋白90為包被抗原，建立了檢測流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的間接ELISA[57]。

2.5 豬寄生蟲疾病的診斷

何光志等建立的檢測豬旋毛蟲抗體的間接ELI?SA所用的包被抗原是豬旋毛蟲重組Ts88蛋白[58]。江濤等建立的檢測豬弓形蟲抗體的間接ELISA是以弓形蟲重組微線體蛋白3（rMIC3）為包被抗原的[59]。王秋霞等建立的快速檢測豬囊尾蚴病的間接ELISA所用的包被抗原是豬囊尾蚴重組蛋白M13h[60]。

3 小結

豬病的發(fā)生和流行是影響和制約我國養(yǎng)豬行業(yè)發(fā)展的重要因素，由于畜產(chǎn)品國際間交流的日益頻繁，一些豬傳染病流入我國，導致某些新侵入的傳染病快速傳播，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大危害[62]。這就需要簡單方便、快速、準確、經(jīng)濟實用等優(yōu)點的方法檢測豬疾病。目前用于檢測我國豬病的國產(chǎn)ELISA主要是間接ELISA，相信隨著技術發(fā)展，我國ELISA技術的敏感性、特異性會更強，準確性會更高，操作會更簡單、快速和經(jīng)濟更實惠，種類會更多。

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