參芎注射液對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠記憶損傷的保護(hù)作用

河南省上蔡縣人民醫(yī)院（463800）李國(guó)選

參芎葡萄糖注射液是丹參素、川芎嗪復(fù)合制劑，丹參素、川芎嗪為傳統(tǒng)的活血化淤中藥提取物[1][2]。既往研究表明參芎注射液可有效改善腦梗死大鼠血液粘滯狀態(tài)、抑制炎癥反應(yīng)、抑制血小板聚集、減少氧自由基的產(chǎn)生、下調(diào)Caspase-3等表達(dá)、上調(diào)BCL-2表達(dá)，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡和抗炎的作用[3][4]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血事件的發(fā)生往往伴有神經(jīng)行為學(xué)與學(xué)習(xí)記憶能力的異常，而神經(jīng)遞質(zhì)興奮性氨基酸和及其相應(yīng)受體與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系非常密切，但參芎注射液改善缺血誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷作用是否與其腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)，目前還未見報(bào)道。本研究試圖用重復(fù)腦缺血再灌注建立學(xué)習(xí)記憶損傷的小鼠模型，從神經(jīng)遞質(zhì)方面探究參芎注射液對(duì)缺血誘導(dǎo)小鼠記憶損傷的保護(hù)作用，為闡明參芎注射液抗腦缺血的腦內(nèi)機(jī)制提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用ICR雄性小鼠，90只，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[中國(guó)上海，合格證號(hào)SCXK（滬）2008-0016]，購(gòu)入時(shí)體重18～22g，8只/籠飼養(yǎng)，12/12小時(shí)光/暗周期調(diào)節(jié)，室溫23±1℃恒溫，濕度50～60%，自由進(jìn)食進(jìn)水。動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)后，方可開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)同批體重范圍不超過2g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥物 2%戊巴比妥鈉；參芎葡萄糖注射液（佰塞通）：上海景峰制藥有限公司，每100ml含丹參素20mg、川芎嗪100mg。

1.3 主要儀器設(shè)備 小鼠跳臺(tái)儀，Morri水迷宮（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；被動(dòng)回避反應(yīng)箱；LC-6A高效液相色譜儀和RF-530熒光檢測(cè)儀（日本島津）；TG328A型電子分析天平GL-20A型高速冷凍離心機(jī)（湘儀總廠離心機(jī)廠）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥 健康雄性小鼠隨機(jī)分5組：假手術(shù)組（12只）、缺血模型組（11只）、參芎注射液高劑量組（12只，80mg/kg）、參芎注射液中劑量組（13只，40mg/kg）、參芎注射液低劑量組（12只，20mg/kg）。參芎注射液治療組分別腹腔注射不同劑量的參芎注射液，連續(xù)給藥7d。模型組和假手術(shù)組在相同時(shí)間點(diǎn)注射等量生理鹽水。第7d給藥后30min 做缺血再灌注手術(shù)，術(shù)后第2～7d進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，期間繼續(xù)給藥。

2.2 動(dòng)物模型的制備 2%戊巴比妥鈉腹腔注射（40mg/kg）麻醉后，將小鼠仰臥固定，切開頸部皮膚，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷兩側(cè)血流造成前腦缺血，8min后松開動(dòng)脈夾恢復(fù)血流即為再灌注，10min后再次阻斷血流，缺血8min后松開動(dòng)脈夾，實(shí)行再灌注，并縫合頸部皮膚。出現(xiàn)心跳加快，呼吸幅度加深，頻率先加快、后減慢典型生理變化過程的小鼠，作為缺血成功樣本入選。對(duì)照組行假手術(shù)，即分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈但不阻斷血流。

2.3 自發(fā)活動(dòng)觀察 術(shù)后第2d進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)時(shí)，環(huán)境保持絕對(duì)安靜，室溫20～24℃，濕度50～70%，光照度800～1200LUX，抓拿動(dòng)物及給藥時(shí)，動(dòng)作輕柔，盡量減少外部刺激給動(dòng)物帶來的精神狀況和情緒的不良反應(yīng)，并將小鼠預(yù)先在環(huán)境中適應(yīng)30min，將其放入自發(fā)活動(dòng)箱中活動(dòng)1h，觀察記錄運(yùn)動(dòng)軌跡，用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2.4 跳臺(tái)試驗(yàn)的觀察 術(shù)后第2～3d進(jìn)行。測(cè)試裝置為被動(dòng)回避反應(yīng)箱，先讓小鼠在反應(yīng)箱內(nèi)銅柵上（未通電）適應(yīng)環(huán)境3min，然后給銅柵充電，動(dòng)物由臺(tái)上跳下后，受到電刺激后產(chǎn)生痛覺，會(huì)立即跳回平臺(tái)以回避電擊，如此連續(xù)訓(xùn)練10min，記錄訓(xùn)練過程中錯(cuò)誤次數(shù)（動(dòng)物下臺(tái)受到電擊的次數(shù)）及10min內(nèi)受到電擊的總時(shí)間，作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24h后，將動(dòng)物再次置于臺(tái)上，以同樣方式考察記憶保持。記錄動(dòng)物第一次跳下平臺(tái)的潛伏期及10min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)和受到電擊的總時(shí)間，作為記憶結(jié)果。

2.5 空間學(xué)習(xí)記憶的測(cè)試 空間學(xué)習(xí)記憶的訓(xùn)練與測(cè)試參照Morris水迷宮法[5]，術(shù)后第4d進(jìn)行。水迷宮是一個(gè)直徑為90cm，高為45cm的黑色圓形水池，池內(nèi)水深25cm，水溫（27±1）℃，一個(gè)8cm×8cm 透明玻璃制成的逃避平臺(tái)固定在水面下1cm處。訓(xùn)練時(shí)把小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，即潛伏期。小鼠在平臺(tái)上停留30s后，放回飼養(yǎng)籠內(nèi)休息30min，然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練，每次在不同象限將小鼠面向池壁放入水中。如果小鼠在90s內(nèi)找不到平臺(tái)，就人為把小鼠放到平臺(tái)上停留30s，這時(shí)找到平臺(tái)的時(shí)間記錄為90s。每天連續(xù)訓(xùn)練4次，并取4次的平均值作為當(dāng)天的成績(jī)。以上訓(xùn)練為期3d，作為學(xué)習(xí)成績(jī)。

訓(xùn)練時(shí)小鼠找到逃避平臺(tái)所用時(shí)間越少，表明其學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。術(shù)后第7d進(jìn)行測(cè)試，作為記憶能力的測(cè)試。

2.6 腦組織谷氨酸含量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第8d將實(shí)驗(yàn)小鼠迅速斷頭，快速取出腦皮質(zhì)、雙側(cè)海馬（置于冰塊上），新鮮腦組織洗凈血液，擦干，稱質(zhì)量后倒入Ependof管中加入0.1mol/L鹽酸（HCl）在冰浴下超聲粉碎細(xì)胞，制成勻漿，12000r/min離心10min。勻漿后離心取上清液200μL，加入衍生劑DNFB，于70℃恒溫水浴中衍生20min，加磷酸鹽緩沖液至1ml，高速離心15000r/min，10min，取上清液進(jìn)樣。色譜條件：流動(dòng)相為醋酸鈉緩沖液，乙腈；流速為1ml/min；波長(zhǎng)為360nm；柱溫為35℃；滿標(biāo)吸光度（AUFS）：0.01。

總之，參芎注射液能減輕缺血再灌注引起的腦損傷，改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，該作用可能與其提高腦組織谷氨酸含量有關(guān)。