艾灸刺激穴位局部感受的生物學(xué)基礎(chǔ)

余曙光 唐 勇 尹海燕 吳巧鳳 羅 玲 張承舜 王家平 趙 利 魯 娟 左 甲 范亞朋 周新異

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都，610075)

中醫(yī)學(xué)認為，穴位是臟腑、經(jīng)絡(luò)之氣輸注于體表的特定部位，既是臟腑疾病在體表的反應(yīng)點，又是針灸疏通氣血、調(diào)整臟腑功能的激發(fā)點。因此，穴位在艾灸中的作用至關(guān)重要。已有的研究成果認為，艾灸的主要作用機理是由艾葉燃燒時所產(chǎn)生的物理因子和化學(xué)因子作用于腧穴感受裝置與外周神經(jīng)傳入途徑，刺激信號傳入中樞，經(jīng)過整合作用傳出信號，調(diào)控機體神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等，從而調(diào)整機體內(nèi)環(huán)境，以達到防治疾病的目的［1－2］。從這一復(fù)雜的作用程序來看，穴位既是艾灸取得臨床療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是艾灸作用的始動環(huán)節(jié)。而始動環(huán)節(jié)往往對后期環(huán)節(jié)的發(fā)生與發(fā)展起到?jīng)Q定性作用。因此，從穴位局部的源頭去探尋艾灸的作用機理，可能是艾灸作用機理研究的重要突破口。那么，穴位接受艾灸刺激后會有什么樣的反應(yīng)?其反應(yīng)特征如何?目前，尚未有清晰的回答。我們在973計劃課題的資助下，重點從穴位局部溫度、血流、分子事件、免疫、瞬時感受器電位(Transiennt Receptor Potential，TRP)通道、嘌呤信號等環(huán)節(jié)進行初步詮釋艾灸穴位局部感受的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 艾灸刺激后穴位局部溫度的變化

艾灸療法主要是通過燃燒艾絨產(chǎn)生溫熱，刺激人體體表穴位局部來達到治病保健的目的。傳統(tǒng)的艾灸治療方法非常豐富，不僅有溫和灸方法，還有隔姜灸、隔附子餅灸等多種隔物灸方法。無論哪種艾灸治療方法，其最基本的刺激均為溫熱刺激。而艾絨燃燒時的局部溫熱效應(yīng)是艾灸產(chǎn)生療效的重要因素。艾絨燃燒時產(chǎn)生的溫度刺激是艾灸局部溫熱效應(yīng)的重要體現(xiàn)。施灸穴位局部的皮膚是感受艾灸溫熱刺激的第一線?，F(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)，在艾灸的操作過程中，溫度處于不斷的升降變化之中，而且不同艾灸方法具有穴位局部不同特征的溫度曲線［3］。但是目前結(jié)合人體試驗觀察常用艾灸方法的溫度曲線特征相對較少。

為此，我們通過招募志愿者，運用熱電偶測溫儀實時動態(tài)監(jiān)測健康人足三里接受溫和灸、隔附子餅灸和隔姜灸三種不同灸法刺激后穴局部的溫度曲線研究發(fā)現(xiàn):溫和灸施灸后快速升溫，溫度遞增的幅度較小，呈小幅度的波動，撤灸后，溫度先迅速下降5～6℃后便進入緩慢下降期，到約25 min時溫度回到艾灸前水平;隔物灸施灸后隨著壯數(shù)的增加溫度不斷升高，后一壯較前一壯的溫度遞增幅度較大，且呈現(xiàn)出梯度上升的特點，即后一壯的波谷較前一壯有上抬趨勢，后一壯波峰高于前一壯的現(xiàn)象;隔物灸在撤灸后，溫度有小幅度的回抬，隨后迅速下降回到艾灸前水平。另外，在最高溫度方面，我們發(fā)現(xiàn):溫和灸皮膚最高溫度為(46.28±2.12)℃，皮膚不起泡;隔附子餅灸皮膚最高溫度為(48.96±3.26)℃，部分受試者穴位會起灸泡;隔姜灸皮膚最高溫度為(52.62±4.46)℃，灸后均有灸泡產(chǎn)生，程度較隔附子餅灸明顯。3種灸法的最高溫度表現(xiàn)為:隔姜灸＞隔附子餅灸＞溫和灸。

2 艾灸刺激后穴位局部血流的改變

目前研究證實艾灸改善微循環(huán)療效確切，艾灸療效的發(fā)揮是由艾灸的藥物成分，燃燒過程中產(chǎn)生的溫熱刺激和紅外輻射共同作用的結(jié)果，能啟動血管的自律運動，改善局部微循環(huán)，這也可能是艾灸活血化瘀作用的途徑之一。另外，艾灸可以改善患者甲皺微循環(huán)的血流速度、血流形態(tài)、血管管徑等指標［4－6］;艾灸可以引起手部微循環(huán)血流量的增加［7］。對血瘀證的研究也發(fā)現(xiàn)［8］，艾灸能降低血瘀證大鼠血漿和全血黏度。

但是艾灸后穴位局部血流改變?nèi)绾?我們采用運用激光多普勒血流儀監(jiān)測健康受試者足三里穴艾灸前后血流灌注量。結(jié)果表明:溫和灸組、隔附子餅灸組、隔姜灸組艾灸前血流灌注量比較，3組間血流灌注量無差異(P＞0.05);艾灸后，3組間血流灌注有差異(P＜0.05)，隔姜灸＞隔附子餅灸＞溫和灸。

3 艾灸刺激后穴位局部的全局分子事件

艾灸刺激后穴位局部溫度升高、血流加速，是否會進一步引起穴位局部不同的基因表達變化?為全面篩選穴位局部接受艾灸刺激后的差異基因，我們選擇全基因表達譜芯片和生物信息學(xué)技術(shù)相結(jié)合，以“足三里”為代表，探索“足三里”穴位局部在不同狀態(tài)下(生理、病理)接受艾灸刺激后基因表達譜的響應(yīng)及其響應(yīng)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn):生理狀態(tài)下，艾灸后“足三里”穴位局部的差異表達基因217個，其中上調(diào)基因145個，下調(diào)基因72個;病理狀態(tài)下，艾灸后“足三里”穴位局部的差異表達基因498個，其中上調(diào)基因255個，下調(diào)基因243個;生理、病理狀態(tài)下，“足三里”穴位局部對艾灸刺激響應(yīng)的共表達差異基因27個。另外也發(fā)現(xiàn)，不同機體狀態(tài)，穴位局部對艾灸刺激應(yīng)答的差異基因表達譜特征不同:生理狀態(tài)下，“足三里”穴位局部對艾灸刺激應(yīng)答基因可能主要富集于代謝相關(guān)的信號通路，參與代謝相關(guān)生物過程;病理狀態(tài)下，“足三里”穴位局部對艾灸刺激應(yīng)答基因可能主要富集于免疫相關(guān)信號通路，啟動機體的免疫應(yīng)答生物過程。其中Hspa1a、Ank1、Ccnb1、Stmn1、Nedd4、Ube2c、Lgmn、Parvb、Areg、Ccna2、Ccnb2、Cpa3、Mad2l可能是病理狀態(tài)下穴位局部對艾灸刺激應(yīng)答中起關(guān)鍵調(diào)控作用的節(jié)點。這些差異基因或共表達差異基因、關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點都將是下一步深入探索艾灸穴位局部分子機制新的靶點。

4 艾灸刺激后穴位局部免疫變化

目前針灸研究者基本達成共識:針灸對神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)具有良好的調(diào)整作用，這是針灸對機體免疫調(diào)節(jié)的重要途徑。但是，隨著免疫學(xué)研究成果和研究思路的不斷深入，目前越來越多的研究表明，皮膚不僅是一種物理屏障，能阻止外界物質(zhì)機械侵入和防止體內(nèi)水分、營養(yǎng)物質(zhì)等丟失，它還是一種免疫系統(tǒng)。在皮膚免疫系統(tǒng)中，其細胞成分包括郎罕細胞，T、B細胞，角質(zhì)形成細胞，內(nèi)皮細胞，巨噬細胞;分子成分則包括各種細胞因子、神經(jīng)肽、各種免疫蛋白等，這些細胞成分和分子成分在皮膚局部構(gòu)成了特有的免疫系統(tǒng)，并和神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)一起，形成皮膚—神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(NICS)，介導(dǎo)免疫應(yīng)答及其調(diào)節(jié)［9－12］。

我們分別以衰老模型和佐劑性關(guān)節(jié)炎模型為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，艾灸后施灸部位皮膚MHC－II、IL－12、CD80、波形蛋白或瘦素、瘦素受體等與皮膚免疫密切相關(guān)的蛋白表達陽性細胞數(shù)均顯著多于模型組(P＜0.01)。由此可能啟示:艾灸對免疫低下和免疫紊亂的調(diào)節(jié)，施術(shù)局部皮膚免疫功能的激活也可能是其重要的一個途徑。這樣，與以前的神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)相互結(jié)合，可能形成艾灸－皮膚－神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，以更全面地闡釋艾灸的免疫調(diào)節(jié)作用基礎(chǔ)。也許還是其他施術(shù)于穴位局部的針灸特色療法(如滾針、皮膚針、拔罐、推拿等)實現(xiàn)機體免疫調(diào)節(jié)的始動環(huán)節(jié)。

5 艾灸刺激后穴位局部瞬時感受器電位(TRP)通道的激活

近年研究發(fā)現(xiàn)，TRP通道是軀體感覺系統(tǒng)感受溫度刺激的重要初級分子換能器［13］。TRP家族成員很多，包含 7個亞家族，即由 TRPV、TRPC、TRPM、TRPML、TRPP、TRPA、TRPN 等家族組成;分布也較廣泛，除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，還分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、心血管系統(tǒng)，以及免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)等。TRPV1主要表達于Aδ纖維和C類纖維，以及角質(zhì)細胞、肥大細胞、脂肪細胞、朗格罕細胞及平滑肌細胞;TRPV2主要表達于背根神經(jīng)節(jié)(DRG)、Aβ纖維和Aδ纖維，也表達于角質(zhì)細胞和肥大細胞;TRPV3和TRPV4都不僅表達于角質(zhì)細胞，而且也表達于感覺神經(jīng)元［14－18］。

不同的TRP通道感受溫度閾值不一，其中TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4 與溫熱刺激相關(guān)，而 TRPM8、ANKM1主要感受冷刺激;與溫熱刺激有關(guān)的溫度閾值分別為:TRPV1:＞42°C，TRPV2:＞52°C，TRPV3:32 –39°C，TRPV4:27 –34°C;TRPV1、TRPV2 感受的溫熱刺激主要是損傷性熱刺激;TRPV3、TRPV4感受的溫熱刺激主要是非損傷性熱刺激［19－23］。我們通過點制TRP功能基因芯片分類及結(jié)合熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn):Trp家族的響應(yīng)是，生理、病理狀態(tài)下均有應(yīng)答，且不同艾灸刺激響應(yīng)各異。生理狀態(tài)下，溫和灸引起Trpv3上調(diào)，Mcoln1、Trpc1下調(diào);隔附子餅灸 Trpv2上調(diào)，Trpc1下調(diào)。在病理狀態(tài)下，溫和灸組引起Trpv3上調(diào)，Trpc1下調(diào);隔附子餅灸Trpv2上調(diào)，Mcoln1下調(diào)。本次研究暫未發(fā)現(xiàn)Trpv1和Trpv4的響應(yīng)變化。具體原因我們正在進一步深入分析。

6 艾灸刺激后穴位局部嘌呤信號的變化

嘌呤信號包括嘌呤類物質(zhì)及其受體。嘌呤類物質(zhì)包括三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)及其代謝產(chǎn)物二磷酸腺苷(Adenosine Diphosphate，ADP)、一磷酸腺苷(Adenosine Monopho sphate，AMP)和腺苷(A-denosine，ADO)，均屬于神經(jīng)遞質(zhì)，具有傳遞信息的作用。嘌呤受體包括P1(腺苷)和P2(腺嘌呤核苷酸)受體兩大類。P1受體已全部被克隆，分為A1、A2和A3種類型，其中 A2受體又分為 A2a和 A2b兩種亞型［24］;P2受體又分為P2X和P2Y受體，迄今已有7型P2X受體(P2X1－7)、9型 G蛋白偶聯(lián)的 P2Y受體(P2Y1，P2Y2，P2Y4，P2Y6，P2Y11，P2Y12，P2Y13，P2Y14)被克?。?5］。P1受體主要對ADO和AMP反應(yīng)性強，P2嘌呤類受體對ATP和ADP反應(yīng)性強［24－26］。

2010年5月，Nature Neuroscience發(fā)表美國羅徹斯特大學(xué)Maiken Nedergraard教授課題組針刺鎮(zhèn)痛通過穴位局部嘌呤信號腺苷及A1受體介導(dǎo)的研究成果［27］，并于2011年12月在Journal of Pain發(fā)表研究文章表明:給予健康人針刺足三里后穴位局部腺苷水平升高［28］，進一步證實了動物實驗結(jié)果，為穴位局部腺苷介導(dǎo)針刺鎮(zhèn)痛提供了證據(jù);2011年，英國Geoffrey Burnstock教授在《The Scientist》撰文指出嘌呤信號參與針灸工作原理輪廓:1)針灸針通過提插捻轉(zhuǎn)機械刺激引起皮膚變形，導(dǎo)致皮膚角質(zhì)細胞釋放ATP;2)激活位于皮膚感覺神經(jīng)末梢的ATP的特定受體(如P2X3、P2X2/3受體);3)信號通過背根神經(jīng)節(jié)到達脊髓，然后通過中間神經(jīng)元途徑到達腦干、在大腦皮層的痛覺區(qū)，傳遞信息抑制疼痛［29］。基于“針所不為、灸之所宜”的指導(dǎo)，我們提出假說認為，可能艾灸和針刺穴位局部的嘌呤信號感受存在差異。通過初步研究發(fā)現(xiàn)，艾灸“足三里”對完全弗氏佐劑(CFA)造模誘導(dǎo)的小鼠炎癥疼痛，具有顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng);同時，CFA誘導(dǎo)的疼痛模型小鼠接受艾灸刺激后“足三里”穴位局部ATP含量升高;在“足三里”給予ATP促分解劑后，鎮(zhèn)痛效應(yīng)降低;但給予ATP分解抑制劑后，艾灸鎮(zhèn)痛效應(yīng)增強。初步顯示穴位局部ATP與艾灸鎮(zhèn)痛效應(yīng)相關(guān)，這和針刺后“足三里”穴位局部腺苷含量升高截然不同，有待深入研究。

7 未來的工作

穴位局部在艾灸防治疾病中究竟處于什么樣的地位和角色，目前的研究尚不夠深入、全面。今后需要回答的問題包括:1)穴位局部感受的艾灸刺激成分是什么?整個艾灸治療過程，涉及到可能對穴位局部產(chǎn)生的成分應(yīng)包括:熱(艾灸后的產(chǎn)熱)、光(艾灸燃燒過程中的紅外光輻射)、藥(艾或者其他藥物成分)、煙(艾灸燃燒后的艾煙成分，如焦油等)、味(艾灸過程的氣味)等。目前研究較多的為熱和光，其他刺激成分作用如何?不同刺激成分的穿透深度怎樣?所有刺激成分相加的疊加效應(yīng)如何?即使是溫熱刺激，也應(yīng)進一步明確艾灸刺激的損傷性和非損傷熱刺激分別等等。2)穴位局部感受的生理結(jié)構(gòu)是什么?角質(zhì)細胞、肥大細胞、梅克爾細胞(Merkel's cell)抑或其他?不同刺激成分相應(yīng)的是什么結(jié)構(gòu)接受感受?3)穴位局部感受后的生物學(xué)機制是什么?穴位局部接受不同刺激成分感受后，其治療效應(yīng)(局部治療效應(yīng)、整體治療效應(yīng)或內(nèi)臟、遠端調(diào)節(jié)等)是否有不同的感受后生物學(xué)機制參與?

［1］Kenji Kawakita1，Hisashi Shinbara，Kenji Imai，et al.How Do Acupuncture and Moxibustion Act?–Focusing on the Progress in Japanese Acupuncture Research［J］.J Pharmacol Sci，2006，100:443.

［2］王磊，李學(xué)武，張莉.艾灸療法作用機理國內(nèi)外研究進展［J］.中國針灸，2001，21(9):56.

［3］董新民，董泉聲，先茂全，等.不同灸法對穴位溫度影響的對比觀察［J］.中國針灸，1999，19(1):22.

［4］張祖德，郭周義，魏華江，等.近紅外激光照射人體勞宮穴和非穴位區(qū)的反射光譜特性的比較研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(11):2930－2933.

［5］郭潤林，趙寧俠，任秦有，等.艾灸對30例健康人甲皺微循環(huán)及血流變學(xué)的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002，23(12):1112 －1114.

［6］李愛華，萬志杰.艾灸百會穴對中風偏癱病人甲皺微循環(huán)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2003，31(2):27.

［7］張棟，李順月，王淑友，等.運用激光多普勒血流成像儀探討針灸作用原理的初步研究［J］.中國針灸，2004，24(7):499 －502.

［8］張慶富，周慧敏.局部溫度變化對人體足甲襞微循環(huán)的影響［J］，中國血液流變學(xué)雜志，2010，20(1):55 －57.

［9］Dirk Roosterman，Tobias Goerge，Stefan W.Schneider，et al.Neuronal Control of Skin Function:The Skin as a Neuroimmunoendocrine Organ.Physiol［J］.Rev，2006，86:1309 － 1379.

［10］Andrzej S，Jacobo W.Neuroendocrinology of the Skin［J］.Endocr Rev，2000，21(5):457 －487.

［11］Nestle FO，Di Meglio P，Qin JZ，Nickoloff BJ.Skin immune sentinels in health and disease［J］.Nat Rev Immunol，2009，9(10):679 － 691.

［12］Dirk Roosterman，Tobias Goerge，Stefan W.et al.Neuronal Control of Skin Function:The Skin as a Neuroimmunoendocrine Organ.Physiol［J］.Rev，2006，86:1309 － 1379.

［13］Romanovsky AA.Thermoregulation:some concepts have changed.Functional architecture of the thermoregulatory system［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，292:37 －46.

［14］Venkataehalam K，Montei1 C.TRP Channels［J］.Annu Rev Biochem，2007，76:387 －417.

［15］Clapham DE.TRP channels as cellular sensors［J］.Nature，2003，426(6966):517－524.

［16］Voets T，Droogmans G，Wissenbach U，et al.The principle of temperature－dependent gating in cold－and heat－sensitive TRP channels［J］.Nature，2004，430(7001):748 － 754.

［17］Peier AM，Reeve AJ，Andersson DA，et al.A heat－ sensitive TRP channel expressed in keratinocytes［J］.Science，2002，296(5575):2046 －2049.

［18］Clapham DE.Signal transduction.Hot and cold TRP ion channels［J］.Science，2002，295(5563):2228 －2229.

［19］Caterina，M.J.＆ Julius，D.The vanilloid receptor:a molecular gateway to the pain pathway［J］.Annu.Rev.Neurosci，2001，24:487 – 517.

［20］Ramsey，I.S.，Delling，M.＆ Clapham，D.E.An introduction to TRP channels［J］.Annu.Rev，2006，68:619 – 647.

［21］Dhaka，A.，Viswanath，V.＆ Patapoutian，A.TRP ion channels and temperature sensation［J］.Annu.Rev.Neurosci，2006，29:135 – 161.

［22］Lee，H.＆ Caterina，M.J.TRPV channels as thermosensory receptors in epithelial cells［J］.Pflügers Arch，2005，451:160 – 167.

［23］Lumpkin EA，Caterina MJ.Mechanisms of sensory transduction in the skin［J］.Nature，2007，445(7130):858 －865.

［24］Nell PG，Albrecht－ Küpper B.The adenosine A1 receptor and its ligands［J］.Prog Med Chem，2009，47:163 －201.

［25］Abbracchio MP，Burnstock G，Verkhratsky A，et al.Purinergic signaling in the nervous system:an overview［J］.Trends Neurosci，2009，32:19 －29.

［26］Khakh BS，North RA.P2X receptors as cell－ surface ATP sensors in health and disease［J］.Nature，2006 Aug 3，442(7102):527 － 532.

［27］Goldman N，Chen M，F(xiàn)ujita T，Xu Q，Peng W，Liu W，Jensen TK，Pei Y，Wang F，Han X，Chen JF，Schnermann J，Takano T，Bekar L，Tieu K，Nedergaard M.(2010)Adenosine A1 receptors mediate local anti－nociceptive effects of acupuncture［J］.Nat Neurosci，13:883 － 888.

［28］Takano T，Chen X，Luo F，F(xiàn)ujita T，Ren Z，Goldman N，Zhao Y，Markman JD，Nedergaard M.Traditional acupuncture triggers a local increase in adenosine in human subjects［J］.J Pain，2012 Dec，13(12):1215 －23.

［29］Geoffrey Burnstock.Puncturing the Myth Purinergic signaling，not mystical energy，may explain how acupuncture works［J］.The Scientist，September 1，2011.