皮下埋置實(shí)驗(yàn)對(duì)增塑淀粉生物安全性的評(píng)價(jià)

徐小川，姚 源，田 偉

(1北京積水潭醫(yī)院，北京100035;2北京市創(chuàng)傷骨科研究所)

淀粉作為天然高分子化合物在可再生資源中占據(jù)非常重要地位，具有豐富、價(jià)廉、可再生、不枯竭、污染小、可生物降解、生物相容性好、穩(wěn)定性高、安全、無(wú)毒等特點(diǎn)，尤其經(jīng)過(guò)適合的結(jié)構(gòu)重組或修飾，可賦予抑制結(jié)腸癌、降低膽固醇、減少心血管疾病等生理活性，因而對(duì)其研究和利用日益引起國(guó)際上的高度重視［1］。增塑淀粉是北京市新型高分子材料制備與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的新型生物可降解材料，強(qiáng)度和彈性大大優(yōu)于普通淀粉;對(duì)小分子具有很好的吸附性，強(qiáng)于海藻酸鹽類(lèi)多糖，加入止血材料或成骨因子有望在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。因此，評(píng)價(jià)這一類(lèi)醫(yī)療器械及材料植入體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)性也就顯得相當(dāng)復(fù)雜且需要更加謹(jǐn)慎。此前，已經(jīng)對(duì)該材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)試［2］，部分反映了材料的安全性。為進(jìn)一步評(píng)估材料的安全性，我們于2006年5月～2007年4月進(jìn)行皮下埋置實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)以Wistar大鼠為研究對(duì)象，依照YY/T 0127．8-2001(ISO 10993-6:1994)［2］進(jìn)行皮下埋置實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察埋置后4、8、12周局部反應(yīng)。選擇S-99可溶性止血紗布作為對(duì)照材料，S-99主要成分為纖維素，與淀粉均為高分子天然有機(jī)物，臨床中用于外用局部止血、保護(hù)創(chuàng)面，與實(shí)驗(yàn)材料預(yù)期臨床使用相似。

1 材料與方法［3］

1．1 材料 依照中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用Wistar大鼠，雌雄不限。增塑淀粉類(lèi)材料需填裝入直徑1．5 mm、長(zhǎng)5 mm的管內(nèi)。選用臨床使用的輸液器膠管，制成規(guī)定形狀，膠管植入前經(jīng)高溫高壓消毒。增塑淀粉經(jīng)60Co照射消毒備用，對(duì)照為S-99可溶性止血紗布(金臺(tái)牌，北京紡織科學(xué)研究所，密封包裝)。

1．2 方法

1．2．1 埋置方法 術(shù)前1 d對(duì)動(dòng)物手術(shù)部位脫毛。手術(shù)當(dāng)日受試動(dòng)物腹腔注射水合氯醛0．7 mL麻醉，固定后用碘伏對(duì)脫毛部位消毒，然后鋪巾。在大鼠背部?jī)蓚?cè)距脊柱各1 cm處切開(kāi)皮膚，切口長(zhǎng)約1．5 cm;分離皮下組織，將膠管于無(wú)菌情況下植入大鼠背部皮下，每側(cè)各有兩個(gè)植入點(diǎn);實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)膠管植入皮下前分別填入增塑淀粉和止血紗布，止血，縫合線(xiàn)縫合。

1．2．2 觀(guān)察方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在埋植實(shí)驗(yàn)材料后，分別于4、8、12周后分期處死。取出包括皮膚、皮下組織的植入塊，仔細(xì)修整組織塊并取出植入物，對(duì)界面和材料周?chē)M織進(jìn)行大體觀(guān)察。然后，將標(biāo)本置于10%甲醛中固定2 d，石蠟包埋切片，沿植入物長(zhǎng)軸切片，蘇木精—伊紅(HE)染色，組織學(xué)觀(guān)察。主要觀(guān)察纖維包膜的形態(tài)和結(jié)構(gòu)、炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度，以及有無(wú)膿腫、變性壞死、增生等情況。

1．2．3 評(píng)價(jià)方法 根據(jù)管端組織有無(wú)變性、壞死及其程度、炎癥細(xì)胞的數(shù)量、類(lèi)型和浸潤(rùn)范圍進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)，將組織反應(yīng)程度分為以下4級(jí)。重度反應(yīng):管端組織失去原有形態(tài)結(jié)構(gòu)，形成大面積壞死區(qū)，較多嗜中性多形核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn);中度反應(yīng):管端組織小范圍變性壞死，呈中度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);輕度反應(yīng):管端組織無(wú)變性壞死，散在少量慢性炎癥細(xì)胞，可見(jiàn)到淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及異物巨細(xì)胞存在;無(wú)反應(yīng):管端組織沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可由薄層纖維組織包繞小管。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后活動(dòng)正常，進(jìn)食好，傷口一期愈合，無(wú)傷口感染。第4周取材中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)膠管均被纖維包膜完整覆蓋，附近組織無(wú)紅腫、無(wú)血凝塊。HE切片顯示，實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)均表現(xiàn)為異物反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)側(cè)視野有肉芽腫，均屬輕度反應(yīng)。見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖3。第8周取材中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)膠管周纖維包膜厚度較前期無(wú)明顯變薄，外觀(guān)形狀無(wú)明顯變化。HE切片顯示，實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)均表現(xiàn)為吞噬反應(yīng)，均屬輕度反應(yīng)。見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖4。第12周實(shí)驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)膠管周纖維包膜厚度較第8周無(wú)明顯變薄，HE切片顯示實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)均表現(xiàn)為吞噬反應(yīng)，均屬輕度反應(yīng)。見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖5。

3 討論

淀粉作為天然高分子化合物，在可再生資源中占據(jù)非常重要地位。2001年，美國(guó)、比利時(shí)和以色列等國(guó)的研究人員發(fā)現(xiàn)，丙烯酸接枝玉米淀粉及淀粉與聚丙烯酸共混物均表現(xiàn)出較高的抑制胰蛋白酶活性的能力，以及對(duì)鈣、鋅離子有較強(qiáng)的吸附能力，適合作為多肽、蛋白質(zhì)藥物的靶向給藥載體［4］。

采用海藻酸鹽作為組織工程骨支架載體，具有促進(jìn)骨缺損部位骨愈合、防止出現(xiàn)骨不連等優(yōu)點(diǎn)［5，6］，但其凝膠在生理環(huán)境中易溶解并失去凝膠特性，此過(guò)程不能控制和預(yù)測(cè);同時(shí)，因其具有較強(qiáng)的親水性，故對(duì)蛋白質(zhì)吸附較差，缺乏細(xì)胞特異性作用位置。許多研究集中于海藻酸鹽改性或者替代物。目前，研究最多的可吸收支架材料是聚乳酸或聚乳酸—羥基乙酸共聚物［7］，但是二者在降解過(guò)程中容易產(chǎn)生酸，易引起周?chē)M織的炎癥反應(yīng)。增塑淀粉強(qiáng)度和彈性大大優(yōu)于海藻酸鹽及普通淀粉，對(duì)小分子具有很好的吸附性。朱愛(ài)臣等［8］以本實(shí)驗(yàn)材料為基礎(chǔ)制備了淀粉/聚乙烯醇引導(dǎo)組織再生膜，以期應(yīng)用于頜面和身體其他骨組織缺損的修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)中4、8、12周3個(gè)階段，實(shí)驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)的炎性反應(yīng)一直存在且程度相似，顯示增塑淀粉的安全性不低于對(duì)照材料。這可能是因?yàn)槠は陆M織富含血管及疏松結(jié)締組織，異物反應(yīng)表現(xiàn)強(qiáng)烈。同時(shí)，通過(guò)組織學(xué)切片可見(jiàn)放置材料的輸液器膠管周?chē)霈F(xiàn)纖維包膜增厚，而管內(nèi)并未有明顯的炎癥反應(yīng)，提示組織學(xué)所見(jiàn)的細(xì)胞吞噬反應(yīng)部分源于組織對(duì)膠管的反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)采用自身左右對(duì)照［9］，在所有的觀(guān)察期發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)側(cè)、對(duì)照側(cè)均表現(xiàn)為異物反應(yīng)，未見(jiàn)壞死組織，參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)屬輕度反應(yīng)，說(shuō)明增塑淀粉在組織局部的毒性反應(yīng)在可接受范圍。完全沒(méi)有不良作用的材料是很難找到的。生物醫(yī)用材料及裝置植入人體后，必定引起組織反應(yīng)、血液反應(yīng)、免疫反應(yīng)及全身反應(yīng)等生物學(xué)反應(yīng)［10］，而其中又以組織反應(yīng)和血液反應(yīng)為初始反應(yīng)。例如，植入物周?chē)M織將出現(xiàn)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的聚集，并發(fā)生不同程度的急性炎癥。其感染的原因包括:植入手術(shù)過(guò)程中，皮膚或組織損傷，給微生物的侵入提供機(jī)會(huì);生物醫(yī)用材料滅菌不徹底帶來(lái)的污染，生物醫(yī)用材料本身引起的無(wú)菌性炎癥等。因而，在生物學(xué)評(píng)價(jià)中要遵循設(shè)立對(duì)照的原則，只有這樣才能獲得結(jié)果的可比性。

有研究對(duì)若干生物材料采取白細(xì)胞趨化試驗(yàn)、流式細(xì)胞儀法等體外試驗(yàn)方法，以及大鼠皮下埋植、兔肌肉內(nèi)埋植等體內(nèi)試驗(yàn)，來(lái)評(píng)價(jià)材料的組織毒性，并進(jìn)行比較研究，對(duì)體內(nèi)外試驗(yàn)方法和結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明體外、體內(nèi)方法有良好的相關(guān)性［11］。因而，對(duì)于任何生物材料還應(yīng)該參照現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相應(yīng)的體內(nèi)外聯(lián)合試驗(yàn)。

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