神經(jīng)退行性疾病線蟲模型的相關(guān)綜述

朱淼，李莎，劉志培，白煥麗，孟軻音，李忠義，王雄，萬家余，陳志寶

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學，大慶 163319；2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所；3.吉林大學；4.天津大學）

近年來，神經(jīng)退行性疾病越來越多的受到了人們的關(guān)注，然而，高等動物神經(jīng)系統(tǒng)復雜多樣，為研究該疾病帶來了很大的困難。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一種經(jīng)典的模式生物，它的出現(xiàn)使得生命科學等領(lǐng)域許多復雜問題變得簡單化，對生命科學的發(fā)展起著舉足輕重的作用。秀麗線蟲成蟲長約1 mm，身體為半透明，以大腸桿菌OP50為食，繁殖速度快，實驗周期短，易在實驗室培養(yǎng)，對人、動物和植物都沒有危害。新秀麗線蟲已經(jīng)被證明能夠系統(tǒng)的研究神經(jīng)功能、行為、年齡以及神經(jīng)退化疾病[1-5]。

1 朊病毒病線蟲模型

1.1 鼠PrP 表達導致轉(zhuǎn)基因線蟲運動、生長的損傷

朊病毒病是一類致死性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，在哺乳動物中常見瘋牛病、羊瘙癢癥、鹿慢性消耗病、貓海綿狀腦病以及傳染性水貂腦軟化病等；在人身上則發(fā)現(xiàn)了庫魯病、致死性家族失眠癥、克雅氏病以及格斯特曼綜合癥等[6]。迄今為止，其發(fā)病機制依然是一個未解之謎。國內(nèi)外研究人員從不同切入點著手研究，發(fā)現(xiàn)大量與朊蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變、朊病毒致病的相關(guān)重要信息。

朊蛋白有兩種，一種是正常形式的PrPC，一種是致病形式的PrPSC，兩種蛋白的構(gòu)型不同，其理化性質(zhì)也不同，PrPC構(gòu)象改變?yōu)镻rPSC后能引發(fā)人和動物朊病毒病。Kyung-Won Park[7]等用沒有致病性的線蟲作為研究朊病毒病模型，他們提取了細胞形式的鼠朊蛋白（MoPrP），并與CFP 或YFP 融合后（CFP 或YFP是一種指示熒光，證明目的基因成功轉(zhuǎn)入線蟲體內(nèi)），在線蟲的肌細胞壁上表達。通過實驗發(fā)現(xiàn)朊蛋白（PrP）在神經(jīng)元細胞的堆積，將會導致PrPSC類似的分子結(jié)構(gòu)以及細胞顯著凋亡[8-9]。此外，提高PrP 水平將會在其肌細胞中檢測到肌肉相關(guān)疾病，如人體肌炎，多肌炎，皮肌炎，神經(jīng)源性肌肉萎縮[10]。然而，也有相反的報道，細胞形式的PrP 表達對N2a 細胞或初期的神經(jīng)元培養(yǎng)沒有毒性[11-12]。

Kyung-Won Park 等人利用轉(zhuǎn)基因線蟲表達細胞形式MoPrP，并且出現(xiàn)了一種外形驚人的短粗類型的線蟲。盡管該類型的線蟲潛在機制還不清楚，但是其異常的肌肉結(jié)構(gòu)及嚴重的運動損傷提示我們細胞形式的MoPrP 堆積，可能對線蟲產(chǎn)生毒性。事實上，在線蟲的肌細胞壁上表達MoPrP（23-231），它能夠模仿啟動子unc-54 突變，導致肌細胞形態(tài)和功能改變，而且這種獲得性的功能顯性可能有助于我們對朊病毒介導毒性的研究。由于MoPrP（23-231）被檢測到對蛋白水解酶K 沒有抵抗作用，所以，在線蟲肌細胞中產(chǎn)生的MoPrP（23-231）與PrPSC的結(jié)構(gòu)不同[13]。

1.2 在線蟲體內(nèi)PrP 的突變影響蛋白的發(fā)病機制及細胞毒性

MoPrP（Q167R）是密碼子的167 位點由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼嵬蛔兊氖驪rP，MoPrP（Q167R）能夠抑制綿羊癢病。人們構(gòu)建了共表達MoPrP（Q167R）（23-231）-YFP 的線蟲和表達MoPrP（23-231）-CFP的線蟲。通過實驗發(fā)現(xiàn)Q167R 能夠減少在線蟲體內(nèi)PrP 的毒性，其作用機制還不清楚。通過實驗發(fā)現(xiàn)MoPrP（Q167R）（23-231）-YFP 和MoPrP（23-231）-CFP 有共同的表達位點，這種沒有毒性的低聚體可能是由于PrP（Q167R）影響野生型PrP 的折疊導致的。

總之，線蟲和哺乳動物的朊蛋白的折疊是相似的，因此，我們可以用線蟲研究潛在的細胞機制。到目前為止，朊蛋白殺死神經(jīng)元的機制仍是一個謎。

1.3 突變的Fyn 激酶對朊蛋白秀麗線蟲模型的影響

盡管朊蛋白的傳播途徑已經(jīng)被很好的了解，但是朊蛋白神經(jīng)毒性的信號肽激活途徑仍然不被了解，Nicolas Bizat 等鑒別了一種Fyn 相關(guān)激酶src-2，其是從插入一段突變的人PrP 中獲得的，該基因在線蟲體內(nèi)產(chǎn)生毒性。轉(zhuǎn)基因PrP 在質(zhì)膜上表達，部分對蛋白水解酶K（PK）有抵抗作用，突變體PrP 檢測到不溶性的蛋白。src-2 功能的缺失會降低突變體PrP 的神經(jīng)毒性，而不會減少PrP 的蛋白水解酶水平。壽命調(diào)節(jié)因子sir-2.1/SIRT1，是一種sirtuin 的去乙?；福鳛榈鞍咨窠?jīng)毒性改變劑，增加sir-2.1 的劑量會減少PrP 的神經(jīng)毒性，而sir-2.1 功能缺失會加重神經(jīng)毒性。而且這些影響沒有改變對蛋白水解酶K 的抵抗作用。這些結(jié)果顯示了Fyn 能夠調(diào)節(jié)突變體PrP 的神經(jīng)毒性，sirtuin 的激活能夠減緩神經(jīng)毒性的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，Sirtuin 能夠治療潛在的蛋白神經(jīng)毒性，并影響細胞內(nèi)的信號和內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

2 帕金森氏病線蟲模型

帕金森綜合癥是一種黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺神經(jīng)功能受損所致多巴胺與乙酰膽堿平衡失調(diào)的一種慢性疾病，帕金森病是屬于α-共核蛋白錯誤折疊性神經(jīng)退行性疾病，其病理改變主要為蒼白球或殼核部位中的細胞出現(xiàn)病變。以運動遲緩、靜止性震顫和強直為主要特征。在LRRK2 的突變常常發(fā)生在常染色體顯性遺傳和原發(fā)性帕金森疾?。≒D），這些突變普遍發(fā)生在GTP 酶（R1441C/G）和激酶（G2019S）區(qū)域。體外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，R1441C 和G2019S 突變與激酶活性增加相關(guān)。這些LRRK2 基因蛋白的過度表達導致年齡依賴性的多巴胺神經(jīng)元退行性變，行為異常，運動功能障礙，并伴隨著體內(nèi)多巴胺水平的減少。相比之下，R1441C 和G2019S 突變導致比野生型蛋白更嚴重的表型。

Chen Yao 和Rabih El Khoury[14]等構(gòu)建了多巴胺神經(jīng)元表達人野生型LRRK2 基因和兩個多巴胺相關(guān)的突變基因R1441C 和G2019S。這些轉(zhuǎn)基因線蟲有多巴胺方面的病理學特征，包括成人進行性神經(jīng)退化，運動功能障礙并伴隨著多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的缺失。這些不正常的現(xiàn)象可以被外源多巴胺治療。因此，LRRK2 轉(zhuǎn)基因線蟲對于體外研究LRRK2 與多巴胺是非常有用的，而且預示著對多巴胺發(fā)病機制的破解。

從該線蟲模型中可以得到一些啟示：第一，野生型LRRK2、R1441C 和G2019S 過度表達，將會誘導神經(jīng)退化，并伴隨著運動障礙和多巴胺的耗竭。LRRK2 和多巴胺相關(guān)突變基因R1441C 和G2019S的病理學顯性顯示出更嚴重的損傷。這些結(jié)論證明：多巴胺相關(guān)突變基因R1441C 和G2019S 能夠獲得一個有害的功能，誘導神經(jīng)退化和功能缺失。第二，在線蟲體內(nèi)，不激活LRRK2 活性，而K1347A 突變，表現(xiàn)出抑制LRRK2 誘導的多巴胺神經(jīng)退化和行為缺失。這是由于K1347A 突變能夠直接損害GTP 和GTPase 的區(qū)域，隨之而來的是LRRK2 激酶的活性不被激活[15-19]。

該實驗的研究人員認為人們可以利用目前的線蟲模型作為一個平臺，幫助人們研究體外突變的影響和發(fā)病機制，結(jié)果顯示線蟲內(nèi)源LRK-1 的缺失能夠抑制LRRK2 誘導的顯型，也能抑制CAT-2 過度表達誘導的神經(jīng)毒性。此外，已有報道，在果蠅中野生型LRRK2 和G2019S 的過度表達能夠誘導神經(jīng)退化[20]，在LRRK2 突變的轉(zhuǎn)基因鼠模型中發(fā)現(xiàn)鼠變得聰明，R1441C 突變的轉(zhuǎn)基因鼠表現(xiàn)出正常的行為，而且沒有神經(jīng)退化[21]。在哺乳動物模型中，這些LRRK2 相關(guān)的多巴胺線蟲模型對于臨床研究LRRK2 治療多巴胺疾病是非常有用的工具。

3 阿爾茨海默病線蟲模型

阿爾茲海默病（Alzheimers disease，AD）是發(fā)病率最高的神經(jīng)退行性病變，其主要是由于β-淀粉樣蛋白錯誤折疊引起的，是老年癡呆的一種，多發(fā)生于中年或老年早期。1995年，Link[22]將貝塔淀粉樣多肽（1-42）（Abeta1-42）肽段編碼基因轉(zhuǎn)基因到秀麗隱桿線蟲的肌細胞，線蟲肌細胞內(nèi)出現(xiàn)了硫黃素S（thioflavins S）陽性反應沉淀物和進行性運動麻痹的表型，這是第一個AD 的線蟲模型。研究表明阿爾茲海默病主要成分是貝塔淀粉樣多肽（1-42）（Abeta1-42），Abeta1-42 與該病發(fā)生緊密相關(guān)[23-24]。

有研究報道銅離子參與了AD 的病理發(fā)生[25]，該線蟲模型主要用于研究Abeta1-42 與銅的相互作用及其產(chǎn)生的毒性。研究人員將線蟲分別暴露于3 種不同濃度的銅離子（終濃度分別為10-3，10-4，10-6mol·L-1），結(jié)果顯示，隨著銅離子濃度增加，線蟲癱瘓行為也顯著增加，這表明在AD 的發(fā)病過程中，銅離子影響了Abeta1-42 的毒性發(fā)揮。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)銅會改變線蟲體內(nèi)金屬元素的穩(wěn)態(tài)平衡。這是由于Abeta1-42 與銅共同作用，改變了基因sod-1，prdx-2，skn-1，hsp-60，和hsp-16.2 的表達水平，引起活性氧堆積，導致線蟲癱瘓。這些研究結(jié)果將為理解AD患者的神經(jīng)細胞形態(tài)異常和功能障礙提供重要線索。

4 結(jié)論與展望

近年來，隨著人們對線蟲模型研究日益深入，秀麗隱桿線蟲因其獨特的優(yōu)勢，使之成為生物學家借以了解諸多基本生命現(xiàn)象的首選模型。通過轉(zhuǎn)基因、突變體篩選等方法，人們已成功制備秀麗隱桿線蟲的幾種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病模型。研究秀麗隱桿線蟲基因功能時，可以將綠色熒光蛋白與目的基因融合，幫助人們推斷與之緊密相連的目的基因篩選的時間、表達的部位和表達數(shù)量的多少，便于觀察。由于新秀麗線蟲與人類的某些調(diào)控機制的相似性及其結(jié)構(gòu)的簡單性，可以利用秀麗線蟲作為動物模型進行藥物篩選。此外，秀麗線蟲還可以在藥物新靶點的發(fā)現(xiàn)和證實，藥物機制研究，人類疾病模型的復制及藥物干預，化學基因組和毒理學領(lǐng)域有廣泛的應用前景[26]。可以預見，在不久的將來，使用秀麗隱桿線蟲開創(chuàng)的神經(jīng)退行性疾病機理的研究，將能在攻克各種未解決的疾病方面發(fā)揮重要作用。通過研究線蟲的神經(jīng)退行性疾病模型的調(diào)控機制，并將其成果應用于哺乳動物，對延長人的壽命及提高人的生活質(zhì)量有很大意義。

短短幾十年中，以秀麗線蟲為研究對象取得的科研成果層出不窮，線蟲已成為當代生命科學研究中的一個重要的模式生物。相信隨著研究的深入，秀麗線蟲將會為人類生命科學的探索做出更大的貢獻。

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