柑橘中β－葡萄糖苷酶的研究進展

何芒芒，張 蕓，任婧楠，王可興，潘思軼，范 剛

( 環(huán)境食品學教育部重點實驗室，華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖北武漢430070)

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)又稱β-D 葡萄糖苷水解酶。它包括一個異構(gòu)組的酶，能夠水解雙糖或者低聚糖的β-葡萄糖苷鍵以及其它的葡萄糖共軛鍵，從而釋放出糖苷及其配基［1］。β-葡萄糖苷酶廣泛地分布于自然界中，并且在許多的生命過程中都扮演著關(guān)鍵的角色。其中包括香氣的釋放，生物體內(nèi)激素的激活，發(fā)芽過程中細胞壁寡糖的降解，纖維素生物質(zhì)的降解，糖脂的水解，生氰作用，以及次級代謝產(chǎn)物的改造等過程。在植物體中，β-葡萄糖苷酶的活性伴隨在一些進程中，比如激素的激活，對于病原體，微生物，昆蟲，寄生植物以及食草動物的防御機制，花的發(fā)育和色素沉著等。β-葡萄糖苷酶還被認為在細胞壁降解的過程中起到一定的作用。一些植物來源的β-葡萄糖苷酶具有高度的底物專一性，按照其對底物的特異性還可以大致將其分為3 類:第一類是只能水解烴基-β-葡萄糖苷的酶，這類β-葡萄糖苷酶能夠水解纖維二糖等;第二類是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，這類酶能水解對硝基苯-β-D-葡萄糖苷等類似物;第三類是能夠水解烴基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此類β-葡萄糖苷酶能水解纖維二糖、對硝基苯-β-D-葡萄糖苷等［2-3］。在過去的二十年中，β-葡萄糖苷酶受到了人們大量的關(guān)注，主要是因為它在食物排毒，生物質(zhì)轉(zhuǎn)化以及酒和飲料的增香等領(lǐng)域的應(yīng)用。除此之外，β-葡萄糖苷酶還可以用于各種糖苷的合成，這些糖苷在食品，化妝品，制藥以及洗滌劑等領(lǐng)域有著很高的商業(yè)價值。例如:烷基糖苷因具有良好的表面活性劑性能、低毒性以及良好的生物降解性，已成為一種最具前景的非離子型表面活性劑。此外，許多糖苷還具有抗氧化、降低血糖水平、保護膜不受冷凍的侵害以及抑制酪氨酸酶等生物活性。目前，國內(nèi)外的研究學者已經(jīng)對各種來源的β-葡萄糖苷酶的提取、純化及酶學性質(zhì)進行了大量的研究。但是，對于柑橘中的β-葡萄糖苷酶的研究還比較少。并且，內(nèi)源糖苷水解酶在糖苷香氣前體體內(nèi)形成與水解釋放中的作用及其影響因素也少見報道。柑橘的果實中也含有β-葡萄糖苷酶。最值得關(guān)注的是β-葡萄糖苷酶與柑橘果實的香氣有著一定的聯(lián)系。國內(nèi)外研究學者發(fā)現(xiàn)，糖苷類香氣前體的水解釋放可以顯著地增強水果及其加工制品的整體香氣品質(zhì)，是增強及保持水果及其加工制品良好香氣品質(zhì)的有效方法之一。而β-葡萄糖苷酶是糖苷類香氣前體水解釋放的關(guān)鍵酶［4-6］。因此，對于柑橘中β-葡萄糖苷酶的研究可以為柑橘果實香氣的形成機理、增香調(diào)控、提高柑橘加工制品的品質(zhì)等提供理論指導。

1 柑橘中β-葡萄糖苷酶的酶活測定以及分離純化方法

柑橘的果皮、果汁以及果肉中都存在β-葡萄糖苷酶。由于柑橘的不同組織部位的形態(tài)及理化性質(zhì)不同，以及各個組織部位中β-葡糖糖苷酶含量也不同，因此，柑橘不同組織部位中β-葡萄糖苷酶的活性也是不同的。Burns 和Baldwin 研究發(fā)現(xiàn)葡萄柚白皮層中β-葡萄糖苷酶活性最高，其次為果皮，而果汁中的活性最低［7］。Barbagallo 等研究也發(fā)現(xiàn)血橙果肉中β-葡糖糖苷酶的酶活高于離心果汁中的酶活，他們由此得出結(jié)論，柑橘中的β-葡糖糖苷酶主要與固態(tài)部分結(jié)合緊密，有可能與果膠結(jié)合在一起［8］。

1.1 柑橘中β-葡萄糖苷酶的基本性質(zhì)［8-13］

目前有關(guān)柑橘中β-葡萄糖苷酶酶學性質(zhì)的研究很少，只有血橙和瓦倫西亞甜橙中的β-葡萄糖苷酶的相關(guān)研究報道。

血橙(Citrus sinensis(L)Osbeck Tarocco)粗汁中β-葡萄糖苷酶的酶活約為1.5 ×10-3U/g，被檢出的分子量為55、65ku，Km 值為0.267mmol/L，最適pH為4.5，最適反應(yīng)溫度為60℃，75℃時的D 值為3min，Z 值為9.5℃，具有良好的熱穩(wěn)定性，其在血橙成熟過程中酶活呈現(xiàn)上升趨勢，然后降低，此外，葡萄糖對其活性具有明顯的抑制作用，但是果糖和乙醇對其活性沒有影響［8］。

瓦倫西亞甜橙(Citrus sinensis var.Valencia)中的β-葡萄糖苷酶經(jīng)Superdex 凝膠過濾層析處理后的酶活為11ku，經(jīng)Toyopearl HW-55S 凝膠過濾層析處理后測得的酶活為24.5ku，而再經(jīng)BioGel P-100 柱純化后測得的酶活則為55ku。該品種柑橘中β-葡萄糖苷酶的最適pH 為4.5～5.5，在pH5.0 時的最適反應(yīng)溫度為40～45℃，Km 值為0.1146mmol/L［4］。

此外，Burns 曾對瓦倫西亞甜橙汁中的糖苷酶在貯藏過程中的變化進行了研究，并發(fā)現(xiàn)α-半乳糖苷酶酶活在8 周的貯藏期中穩(wěn)定，而β-半乳糖苷酶酶活在這一階段下降了;經(jīng)離子交換和凝膠過濾層析純化后，他們發(fā)現(xiàn)瓦倫西亞橙汁中的α-和β-半乳糖苷酶分別有兩種異構(gòu)體，其Km 值分別為0.47(α-半乳糖苷酶Ⅰ)、0.23(α-半乳糖苷酶Ⅱ)、0.27(β-半乳糖苷酶Ⅰ)和0.77(β-半乳糖苷酶Ⅱ)mmol/L［9］。Burns 和 Baldwin 對葡萄柚(Citrus paradisi Macf.cv.Ruby Red)果皮、白皮層及果汁中的其他糖苷酶在成熟過程中的變化進行了研究，但并未對其酶學性質(zhì)進行測定，他們發(fā)現(xiàn)葡萄柚果皮中的β-半乳糖苷酶酶活在9 月份最高，然后急劇下降，直到11 月份后無明顯變化，果皮中的α-半乳糖苷酶酶活很低，且在葡萄柚成熟過程中無明顯變化，而果皮中的α-甘露糖苷酶酶活在采摘初期酶活很低，隨著果實的成熟，其酶活穩(wěn)步提高;葡萄柚白皮層中的這些糖苷酶的酶活變化規(guī)律與果皮中的差別不大;而果汁中的β-半乳糖苷酶酶活在整個成熟期變化不大，果汁中的α-半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶酶活在初期采收后酶活分別降低了70%和50%［7］。

1.2 柑橘的不同部位粗酶液的制備方法

柑橘皮中β-葡萄糖苷酶粗酶液的制備方法為:將柑橘皮用一定量的檸檬酸-磷酸緩沖液(pH6.0)，冰浴上充分研磨成勻漿，加緩沖液于4℃下浸提60min，然后于10000 × g 冷凍離心15min，然后取上清液用相應(yīng)的緩沖液定容得粗酶液。

柑橘果汁中β-葡萄糖苷酶粗酶液的制備方法為:將柑橘去皮榨汁后直接于20000 × g 冷凍離心30min，上清液可直接測定酶活。所得的沉淀物用一定量的檸檬酸-磷酸緩沖液(pH6.0)于4℃浸提60min，然后于10000 × g 冷凍離心15min，取上清液用相應(yīng)的緩沖液定容得粗酶液。

1.3 柑橘中β-葡萄糖苷酶酶活的測定方法

柑橘中β-葡萄糖苷酶酶活的測定方法主要有三種，第一種是光譜法，該法是根據(jù)柑橘中β-葡萄糖苷酶在一定的溫度和時間條件下可以催化底物p-NPG，生成對硝基苯酚。對硝基苯酚在堿性條件下于402nm 左右處有最大吸收峰，因此，可以以p-NPG為底物通過反應(yīng)產(chǎn)物的顯色來檢測酶活。具體的方法為，在試管中加入一定量的粗酶液，然后加入10mmol/L 的p-NPG，在一定的溫度下反應(yīng)一段時間后加入1mol/L 的Na2CO3終止反應(yīng)。然后在402nm 左右測吸光度，再根據(jù)對硝基苯酚標準曲線計算出酶活［4，8，10］。第二種方法是通過測定釋放出的葡萄糖的含量來計算β-葡萄糖苷酶的酶活。根據(jù)β-葡萄糖苷酶能夠水解β-低聚糖或者β-葡萄糖苷釋放出葡萄糖，釋放出的葡萄糖再采用離子交換色譜脈沖安培檢測器(HPAEC-PAD)進行檢測，響應(yīng)值和糖濃度呈正相關(guān)關(guān)系，并以2-去氧半乳糖為內(nèi)標物確定釋放出的糖含量，從而可計算出β-葡萄糖苷酶的酶活。第三種方法是通過測定釋放出的柑橘中的酚類物質(zhì)來計算β-葡萄糖苷酶的酶活。具體操作是將β-葡萄糖苷酶和一定濃度的橙皮素二氫查耳酮葡萄糖苷、橙皮素-7-O-葡糖苷等糖苷在40℃條件下反應(yīng)2h，然后浸入沸水浴中保持5min 以終止反應(yīng)，再采用高效液相色譜法測定釋放出的酚類物質(zhì)的含量，從而確定β-葡萄糖苷酶的酶活［4］。

1.4 柑橘中β-葡糖糖苷酶的分離和純化方法

由于不同來源的β-葡萄糖苷酶性質(zhì)差異很大，因此，一般沒有適合各種不同體系中的β-葡萄糖苷酶的分離純化的固定方法。但所有分離純化方法的關(guān)鍵步驟、基本手段還是基本一致的。一般來說，分離的第一步是將細胞破碎，使內(nèi)含物從細胞中釋放出來。第二步就是制備粗酶液，然后就可以采用幾種溶解度分級法進行初步分離，再進一步純化。

一般采用多種離子交換層析結(jié)合的方法來進行分離純化柑橘中的β-葡萄糖苷酶。首先由柑橘果實制備粗酶液，然后使用硫酸氨(80%飽和度)沉淀，再用聚丙烯酰胺凝膠(12%)進行電泳純化分析［8］;或者粗酶液分別經(jīng)過DEAE Sephacel、CM-Sepharose及凝膠過濾層析等多步純化在進行分析［4］。

2 柑橘中β-葡萄糖苷酶對柑橘果實香氣的影響

香氣是影響柑橘果實以及其加工制品品質(zhì)的最重要因素之一，研究柑橘的香氣組成，對于防止柑橘加工過程中香氣物質(zhì)的損失、保持柑橘加工制品的特征香氣、提高其總體香氣品質(zhì)具有非常重要的意義。柑橘的香氣主要由酯類、醛類、萜烯類化合物等構(gòu)成，其中萜烯類化合物是柑橘果實香氣中含量最高的一類香氣物質(zhì)，由于這類物質(zhì)具有弱極性，所以它們更容易存在于果肉中。除游離態(tài)香氣物質(zhì)外，柑橘中還存在一類不具揮發(fā)性，與柑橘果實中的糖類物質(zhì)通過糖苷鍵結(jié)合，以糖苷的形式存在的香氣前體物質(zhì)，即糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)(glycosidically bound aroma compounds)［11］。

目前，有關(guān)柑橘中β-葡萄糖苷水解酶對其香氣品質(zhì)影響的研究鮮有報道，但外源β-葡萄糖苷酶對柑橘中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的水解釋放具有明顯的作用。Gueguen 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在橙汁中添加β-葡萄糖苷酶能夠明顯地增加芳樟醇、苯甲醇和苯乙醇的含量。宛曉春等［13］采用Amberlite XAD-2 樹脂吸附洗脫的方法對檸檬汁中的鍵合態(tài)萜類化合物進行了分離，并應(yīng)用β-葡萄糖苷酶對其進行了水解釋放，共檢出9 種鍵合態(tài)香氣物質(zhì)。孫愛東等［14］對甜橙中分離得到的的鍵合態(tài)香氣物質(zhì)進行了β-葡萄糖苷酶酶解釋放，共發(fā)現(xiàn)8 種物質(zhì)，且酶解后的橙汁風味典型溫和。孫愛東等［15］又比較了不同來源的增香酶酶解橙汁中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)微生物來源的β-葡萄糖苷酶對鍵合態(tài)組分的酶解效果略強于杏仁酶的酶解效果。范剛等［16-17］也采用外源β-葡萄糖苷酶水解釋放出了錦橙中的鍵合態(tài)香氣物質(zhì)。葉順君等［18］則發(fā)現(xiàn)杏仁β-葡萄糖苷酶對橙汁和檸檬汁中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的酶解效果好于黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶解效果，且他們采用Kramer 感官評定法研究發(fā)現(xiàn)采用糖苷酶酶解橙汁具有明顯的增香效果。張瑤等［19］等研究了新鮮檸檬汁經(jīng)β-葡萄糖苷酶處理后香氣物質(zhì)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解后，檸檬汁中香氣物質(zhì)的總量增加了11%。由此可見，外源β-葡萄糖苷酶對柑橘汁的香氣物質(zhì)存在一定影響，能夠水解釋放柑橘中的鍵合態(tài)香氣物質(zhì)，增加柑橘香氣物質(zhì)的含量。Fan 等［20］比較了柑橘果酒中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)釀造前后的變化，并發(fā)現(xiàn)共有8 種鍵合態(tài)香氣物質(zhì)在發(fā)酵過程中被水解釋放。

柑橘成熟過程中內(nèi)源β-葡萄糖苷酶也可以釋放出部分鍵合態(tài)萜類物質(zhì)，因此可通過外加β-葡萄糖苷酶增強柑橘加工制品及加工副產(chǎn)品的香氣與風味。例如將β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于柑橘精油、柑橘果酒以及柑橘汁的提取加工工藝中，使得產(chǎn)品的特征香氣更加濃郁。

3 柑橘中β-葡萄糖苷酶的其他作用

β-葡萄糖苷酶也可以分解一些苦味物質(zhì)，使得一些具有苦味的果實加工制品的口感得到改善。例如:梅子中含有大量的苦味物質(zhì)，使得其加工制品的口感較差。而這些苦味物質(zhì)中最主要的就是苦杏仁苷。β-葡萄糖苷酶可以分解苦杏仁苷，使得其苦味大大減輕。然而，在柑橘中則恰恰相反，檸檬苦素類化合物是柑橘中的主要苦味物質(zhì)。這類物質(zhì)在柑橘中與糖類物質(zhì)通過糖苷鍵結(jié)合以糖苷的形式存在，據(jù)報道，檸檬苦素類化合物糖苷在橙汁中的含量約為320mg/kg［21］，在柑橘種子中的含量達干重的0.8%［22］。檸檬苦素類化合物糖苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后，釋放出檸檬苦素類物質(zhì)，引起橙汁苦味。Ronneberg 等［23］研究發(fā)現(xiàn)未發(fā)芽及發(fā)芽檸檬種子中的諾米林17-β-D-吡喃葡萄糖苷(nomilin 17-β-D-glucopyranoside)被水解為諾米林，說明檸檬種子中含有水解糖苷的β-葡萄糖苷酶，并指出榨汁過程中種子被碾碎后，其中的β-葡萄糖苷酶融入果汁中容易水解檸檬苦素類物質(zhì)糖苷，釋放出苦味物質(zhì)，造成果汁的苦味，因此在榨汁過程中要盡量防止種子被碾碎。

β-葡萄糖苷酶還與血橙中花色苷的降解有一定關(guān)系，Barbagallo 等研究發(fā)現(xiàn)血橙中的花色苷含量在果實完熟時最高，之后減少，而在這個過程中，β-葡萄糖苷酶的活性增高，因此他們認為，β-葡萄糖苷酶在血橙花色苷降解過程中起到了一定作用［8］。

β-葡萄糖苷酶存在于許多植物中，其在植物中的作用除水解糖苷鍵以外，還有很多未被發(fā)現(xiàn)的作用，國外研究報道水果中的β-葡萄糖苷酶在細胞壁代謝中也具有重要作用［24-25］。糖苷水解酶具有雙重性，即根據(jù)來源的不同，既可行水解酶活性，又可行糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可以用于酶促糖苷化反應(yīng)［26］。

4 展望

β-葡萄糖苷酶分布于柑橘果實的各個部位，在柑橘果實鍵合態(tài)香氣水解釋放、檸檬苦素類物質(zhì)糖苷水解及花色苷降解過程中起到重要作用。然而由于β-葡萄糖苷酶對環(huán)境的條件較為敏感，極易在柑橘的采摘和加工過程成失活或者變性，從而無法對香氣的釋放做出貢獻。目前通過保持柑橘中β-葡萄糖苷酶的活性進而保持柑橘果實及其加工制品的香氣主要有兩種途徑:一是盡量縮短采摘及加工的時間，在加工過程中避免長時間高溫處理。二是在制品中加入外源的β-葡萄糖苷酶。

目前，國內(nèi)外的研究學者已經(jīng)對各種不同來源的β-葡萄糖苷酶的提取、純化及酶學性質(zhì)進行了大量的研究。然而，對于柑橘中的β-葡萄糖苷酶的研究還比較少，尤其是內(nèi)源糖苷水解酶在糖苷香氣前體體內(nèi)形成與水解釋放中的作用及其影響因素也鮮有報道，其在柑橘中糖苷香氣前體合成及釋放中的作用需要進一步明確。

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