鮮活農產品中單核細胞增多性李斯特菌快速檢測技術的研究進展

關棣鍇，胡文忠 ，姜愛麗，薩仁高娃

(1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034;2.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連116600)

單核細胞增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes)是一種能引起人畜共患的食源性致病菌，其在自然界分布廣泛，對環(huán)境的耐受性強，可造成多種食品的污染，如奶制品、肉制品、水產品、新鮮蔬菜等植物性食品［1］。該菌引發(fā)的人類李斯特菌病致死率高達30%，尤其對孕婦、新生兒、老年人以及免疫功能缺陷者具有較高的感染風險。近些年，食品污染單核細胞增多性李斯特菌而導致的食物中毒爆發(fā)事件日見增多。2011 年9 月，美國爆發(fā)的香瓜李斯特菌中毒事件導致全美24 個州出現李斯特菌感染病例，截止2011 年12 月，30 人確認因感染李斯特菌死亡。2008 年8 月，加拿大共發(fā)生57 起李斯特菌感染事件，造成23 人死亡，死者大部分為老年人。2002 年法國一家公司加工生產的部分肉醬和豬舌受到李斯特菌污染，導致9 人感染，2 人死亡［2］。因此，加強對該菌的認識了解，研制出更快、更有效的檢測方法已刻不容緩。

1 單核細胞增多性李斯特菌的生物學特性和毒力因子

1.1 生物學特性

李斯特氏菌屬共有7 個菌種，即單核細胞增多性李斯特菌、綿羊李斯特菌(Listeria ivanvii)、英諾克李斯特菌(Listeria innocua)、威爾斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、西爾李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)以及默氏李斯特菌(Listeria murrayi)。在這7 個菌種中只有單核細胞增多性李斯特菌是人畜共患致病菌，綿羊李斯特菌是動物致病菌。單核細胞增多性李斯特菌為短小的革蘭氏陽性無芽胞兼性厭氧桿菌，長度為1 ～2μm、寬度為0.5μm，有鞭毛。菌落直徑約0.12～0.14mm，在斜射光下呈典型的藍綠色光澤。在血平板上培養(yǎng)24～96h，菌落呈現β- 溶血。其生長最低溫度有報道為-0.4℃，菌數在4℃保持穩(wěn)定，8℃急劇增加，最高生長溫度約為45℃。生長的pH 范圍在5.16～9.18 之間，但在中性或弱堿性條件下生長最好［3］。

1.2 毒力因子

1.2.1 李斯特菌溶血素O(Listeriolysion O，LLO)LLO 是由hly 基因編碼的Hly 蛋白，與破壞吞噬體，促進菌體進入胞液有關，是細菌得以在胞液內增殖的先決條件，是李斯特菌的一種基本毒力因子，它的缺失將會導致細菌毒力的全部喪失。且大多數PCR都選擇了針對hly 基因進行檢測［10-13，22-23］。Aznar等［4］通過比較8 對引物篩選出針對hly 基因的引物，擴增出702bp 片段，在72 株菌株(標準菌株和食品分離株)中特異地擴增單增李斯特菌的hly 基因，體現出了很強的特異性。

1.2.2 磷脂酶C(phospholipase C，PLC) 單核細胞增多性李斯特菌能產生兩種磷脂酶C:磷脂酞肌醇磷脂酶C(phosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC)和磷脂酞膽堿磷脂酶 C (phosphatidylcholin phospholipase C，PC-PLC)。PI-PLC 由plcA 基因編碼，PC-PLC 由plcB 基因編碼。目前有研究認為PIPLC 毒性相對較小，對細菌在細胞間擴散作用不大，可輔助細菌逸出初級吞噬體，而細菌在細胞與細胞之間的擴散過程中，PC-PLC 則表現出一定的活性作用。也有研究發(fā)現PC-PLC 可介導單核細胞增多性李斯特菌裂解人上皮細胞的初級吞噬體，并且參與細胞與細胞之間的擴散［5］。

1.2.3 毒力調節(jié)因子(PrfA 蛋白) PrfA 蛋白由prfA編碼，可激活所有基因簇的轉錄，對許多毒力因子的定位表達起到了關鍵的調控作用。研究表明，可采用prfA 基因設計的引物和探針在生牛奶、鮭魚肉、奶酪中特異地檢測出單增李斯特菌［6］。

1.2.4肌動蛋白聚集蛋白(act in polymerizing protein，ActA) ActA 蛋白由actA 基因編碼的表面蛋白，通過誘導細胞肌動蛋白分子的聚合作用促使細菌在細胞與細胞之間的傳遞，同時也與細菌被宿主細胞內化有關［7］。

1.2.5細胞壁水解酶(invasion associated protein，P60) P60 蛋白是一種胞壁質水解酶，分子質量為60ku，由iap 基因編碼。有關缺失iap 基因的研究表明，它對于細胞的分裂是必不可少的，與該菌的侵襲性有密切關系。分析P60 蛋白編碼基因的突變體顯示，對于單核細胞增多性李斯特菌的吞噬細胞溶解作用以及對機體的感染過程，P60 蛋白是一個重要的因素［5］。

此外，還有內化素(Internalis，Inl)、表面蛋白104(surface protein 104，SP104)、自溶素(Auto)等幾種毒力因子，這里不再逐一介紹，僅選擇以上幾種主要的毒力因子進行介紹。

2 單核細胞增多性李斯特菌的快速檢測

2.1 分子生物學方法

2.1.1 核酸探針雜交技術 核酸探針雜交技術就是將兩條堿基互補的DNA 鏈在適當的條件下雜交，通過檢測待測樣品與標記性DNA 探針之間形成的雜交分子來判斷樣品中是否存在單核細胞增多性李斯特菌，測定放射性或熒光強度可以得出樣品中單核細胞增多性李斯特菌的個數，其主要是以單核細胞增多性李斯特菌特有的毒力基因為靶基因。例如，Volokhov 等［8］以李斯特菌屬的六種毒力蛋白基因為靶基因，設計多對引物進行多重PCR，擴增產物與基因芯片中的經熒光標記的種特異性寡核苷酸探針雜交，將李斯特菌屬檢測到種的水平，且縮短了檢測時間。也有研究人員根據16S rRNA 和23S rRNA 基因間的間隔區(qū)序列設計PCR 引物，將PCR 產物和單核細胞增多性李斯特菌的特定寡核苷酸探針進行雜交，通過比色法測定雜交體，結果表明，每25mL 樣品中能檢測出1～10cfu［9］。

2.1.2 常規(guī)PCR 技術 常規(guī)PCR 技術已經發(fā)展的相當成熟，它和體內發(fā)生DNA 復制過程十分相似。其與核酸探針雜交相比可以以微量的樣品得到大量的靶DNA 和靶RNA。單核細胞增多性李斯特菌基因組上的hly 基因是常用于PCR 技術中的特異性靶基因。周曉輝等［10］用PCR 擴增hly 基因，檢測單核細胞增多性李斯特菌的純培養(yǎng)物及其模擬污染的生豬肉、水和牛奶。結果表明所擴增的hly 基因3'末段850bp 的DNA 片段對單核細胞增多性李斯特菌有較高的特異性，PCR 對單核細胞增多性李斯特菌純培養(yǎng)物的檢測低限達10cfu·mL-1，對模擬污染生豬肉、水和牛奶的增菌培養(yǎng)液檢測低限均達到400cfu·kg-1，整個檢測過程只需24h。研究發(fā)現，根據單核細胞增多性李斯特菌的hlyA 基因和李斯特菌屬的l6S rRNA 基因分別設計一對引物，將兩對引物組合建立PCR 方法檢測人工污染的食品，檢測限會更低，達1cfu/25g［11］。

隨著檢測技術的不斷深入研究、優(yōu)化，常規(guī)PCR技術與其他技術相結合對鮮活農產品樣品中單核細胞增多性李斯特菌進行檢測已屢見不鮮。M N Marian 等［12］采用MPN-PCR 技術對生鮮和即食食品中的單核細胞增多性李斯特菌進行檢測，擴增16S rRNA 基因的938bp 片段和hlyA 毒力基因的701bp片段，得到94.3%的樣品中單核細胞增多性李斯特菌的數量＜100MPN/g。采用PCR-ELISA 方法快速檢測牛奶樣品中的單核細胞增多性李斯特菌，與傳統(tǒng)PCR 方法相比，可提高檢測敏感性，約為傳統(tǒng)PCR方法的10～100 倍。此方法以單核細胞增多性李斯特菌的致病基因hlyA 為基礎，選用PCR 引物，應用地高辛標記試劑盒，獲得單增李斯特菌特異的地高辛標記片段。最低可從25mL 染菌牛奶中檢出1cfu，完成檢查約需6h［13］。而王麗麗等［14］建立的聚合酶鏈式反應-核酸層析(PCR-NALF)方法可替代常規(guī)PCR 過程中的電泳從而實現更便捷的單核細胞增多性李斯特菌檢測。其通過一對標記生物素和地高辛的引物，對提取自樣品中的DNA 進行擴增，然后用包被親和素和抗地高辛抗體的層析試紙條對擴增產物進行檢測，并通過肉眼可見的紅色條帶進行結果判讀。在特異性實驗中，其他李斯特菌和常見致病菌均呈現陰性反應，與電泳結果一致。

2.1.3 多重PCR 技術 多重PCR(MPCR)也稱復合PCR，主要有兩種形式:將多條引物和多個模板DNA混合在同一個反應體系中分別特異擴增不同的目的條帶;將多條引物和單一的模板DNA 混合在同一反應體系中擴增同一模板的不同片段。具有快捷方便、高效、經濟簡便等優(yōu)點。

徐偉等［15］根據單增李斯特菌轉錄調節(jié)子基因prfA、志賀氏菌侵襲性質?？乖璈 基因ipaH 篩選出引物，優(yōu)化多重PCR 條件，分析單一PCR 及多重PCR 的特異性、靈敏度，且確定多重PCR 檢測人工污染脫脂滅菌乳的檢出限。結果為多重PCR 擴增出預計的PCR 產物，其中單增李斯特菌檢測低限為78pg，人工污染脫脂滅菌乳中檢測低限為2cfu/25mL。也有利用大腸桿菌GADA/B(谷氨酸脫羧酶)、單增李斯特菌hly 和鼠傷寒沙門氏菌invA 基因設計引物進行MPCR 擴增，從小麥中同時檢測出這三種致病菌的［16］。

應用多重PCR 可較好的區(qū)別單核細胞增多性李斯特菌和其他同屬異種的李斯特菌。劉海泉等［17］建立了四重PCR 方法檢測鮮活農產品中的單核細胞增多性李斯特菌。其以16S rRNA、inlAB、iap、hly 基因為靶基因設計引物，從影響多重PCR 擴增的引物濃度、退火溫度進行優(yōu)化，結果表明，英諾克李斯特氏菌、西爾李斯特氏菌、威爾西李斯特氏菌、綿羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未擴增出特異性的片段，單核細胞增多性李斯特菌的最低檢測限為102cfu/mL，模擬污染的生豬肉檢測限不大于0.4cfu/g。研究表明，應用多重PCR 結合變性高效液相色譜(DHPLC)技術對鮮活農產品中單核細胞增多性李斯特菌、綿羊李斯特菌和英諾克李斯特菌快速高通量檢測具有較好的特異性，是鮮活農產品微生物快速檢測的新技術。其根據三種李斯特菌的特異基因序列分別設計引物，MPCR 擴增的產物經DHPLC 技術進行快速檢測［18］。

2.1.4 實時熒光定量PCR 技術 實時熒光定量PCR技術是在常規(guī)PCR 基礎上運用熒光能量傳遞技術，該技術加入熒光標記探針，巧妙地把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術結合在一起，借助熒光信號來檢測PCR 產物。其可即時檢測熒光強度并通過標準曲線對未知模板進行定量，沒有復雜的產物后處理過程，具有快速靈敏的優(yōu)點［19］。劉仲敏等［20］根據GenBank 數據庫單核細胞增多性李斯特菌的O基因序列(AF253320)設計引物，建立單核細胞增多性李斯特菌實時熒光定量PCR 檢測方法。標準曲線的相關系數為0.996，檢出底限約8 個細菌/反應，而常規(guī)PCR 檢出底限約60 個細菌/反應，體現了其較高的靈敏度。熊國華等［21］利用實時熒光定量PCR 技術，建立了DNA 校正曲線、細胞校正曲線和質粒校正曲線，DNA 校正曲線在1～32cfu/mL、細胞校正曲線在32～320cfu/mL、質粒校正曲線在1～37Copies/mL，線形關系良好，且三種校正曲線檢測樣品得出的結果基本吻合，即在1～105cfu 或Copies/mL 線性范圍內對樣品的檢測結果保持高度的一致性。

2.1.5 反轉錄PCR 技術 反轉錄PCR 是在反轉錄酶的作用下，將mRNA 反轉錄合成cDNA，即用引物與mRNA 雜交，再以cDNA 作為模板，借助PCR 技術擴增合成目的片段。由于反轉錄PCR 的起始材料一般是mRNA，而細菌中mRNA 在細菌死后很容易降解，所以可以較好的作為活菌的指示標志。應用反轉錄PCR 可以有效的排除假陽性的產生［19］。Klein PG 等［22］使用這種方法已經成功檢測到了經人工污染肉樣中的單核細胞增多性李斯特菌，通過逆轉錄單核細胞增多性李斯特菌的hly、prfA 和iap 的mRNA，其中以iap 進行逆轉錄從而進行PCR 檢測的特異性和靈敏度是最高的，檢出量為3cfu/g，檢出所需的總時間大約為54h。

2.1.6 競爭PCR 技術 競爭PCR 是將不同濃度的競爭模板和一定量的靶模板混合后進行擴增，用兩種擴增產物的比值作競爭曲線，從曲線上得出靶模板的含量，從而實現細菌的定量檢測。Choi 等人［23］用hlyA基因序列為靶模板進行競爭PCR，在沒有增菌的情況下可以在5h 內測出103cfu/0.5mL 的牛奶樣品。

2.1.7 熒光原位雜交技術 熒光原位雜交(FISH)是將DNA 探針用熒光染料標記，然后將標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA 纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異結合，通過熒光雜交信號來檢測DNA 序列在染色體或DNA 纖維上的定位、定性、相對定量分析。Yolanda Moreno 等［24］采用選擇性鍍層、PCR、DVC-FISH 技術對191 個蔬菜樣品(新鮮的蔬菜、冷凍的蔬菜、氣調包裝下鮮切的蔬菜)進行單核細胞增多性李斯特菌的檢測和鑒別，其中DVC-FISH 技術檢測出32.98%的樣品存在單核細胞增多性李斯特菌活菌，活菌數高達4.97lgcfu/g。

2.2 免疫學方法

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附測定技術 酶聯(lián)免疫吸附測定技術(ELISA)的原理是抗體與酶結合后仍能與相應的抗原發(fā)生特異性結合，將待檢樣品事先吸附在固相載體表面，加入酶標抗體，兩者發(fā)生特異性結合反應，形成酶標記的免疫復合物，不能被緩沖液沖掉，當加入酶的底物時，底物發(fā)生化學反應，呈現顏色變化，顏色深淺與待測抗原或抗體的量相關，借助分光光度計可定量測定抗原或抗體。Yu KY 等［25］將單核細胞增多性李斯特菌的iap 基因編碼的p60 作為抗原，采用單克隆抗體識別p60 的夾心ELISA 法，對單核細胞增多性李斯特菌進行檢測，得到理想效果。ELISA 方法的缺點是容易受污染，靈敏度受抗體吸附能力影響，其主要問題是如何制備高特異性的抗體。目前大多數抗體主要針對李斯特菌屬的細菌，單核細胞增多性李斯特菌種特異性的抗體很少［26］。

2.2.2 酶聯(lián)熒光測定技術 目前酶聯(lián)熒光測定技術(ELFA)常用的標記物為堿性磷酸酶。首先將單核細胞增多性李斯特菌抗原與單克隆抗體結合，再將結合有堿性磷酸酶的抗體與單核細胞增多性李斯特菌抗原結合。當底物4-甲基傘形磷酸酮被磷酸酶轉換成4-甲基傘形酮時，發(fā)出熒光。測得的熒光強度與抗原含量成正比，由此可推算出樣品中單核細胞增多性李斯特菌的個數［27］。美國Vitek 公司生產的VIDAS 自動免疫熒光檢測系統(tǒng)是利用微量免疫技術，將抗原與抗體的特異性反應進行免疫放大來鑒別細菌，樣品經過Fraser 肉湯增菌48h，檢測敏感度達到10cfu/25g，實驗準確性為94.7%，滿足了快速檢測的要求［26］。該方法缺點是成本較高。

2.2.3 金標試紙技術 金標試紙技術的原理是特異性的抗單核細胞增多性李斯特菌及其單核細胞增多性李斯特菌抗原的抗體被縛在色原載體上，并且可與固相支撐基質分離。當有單核細胞增多性李斯特菌存在時，測試單元的試劑被展開，并產生可視的確定反應。單核細胞增多性李斯特菌抗原與抗體色原復合物反應，形成抗原-抗體-色原復合物。此復合物穿過側面流動膜流動，隨后與固定在膜上的抗體結合。陽性反應在測試窗有一指示陽性的模線。研究發(fā)現，利用膠體金標記和雙抗體夾心免疫層析技術建立的單核細胞增多性李斯特菌快速檢測方法可在10min 內完成定性和半定量檢測，定量檢測靈敏度為3.5 × 103cfu/mL，限性范圍3.5 × 105～3.5 ×108cfu/mL，回收率在99%～101.7%之間［28］。

2.3 全自動微生物分析系統(tǒng)檢測

目前國內外已研制出很多全自動微生物分析系統(tǒng)，如VITEK 系統(tǒng)、BIOLOG 系統(tǒng)、MIDD 系統(tǒng)等。其中VITEK-單核細胞增多性李斯特菌的微生物鑒定系統(tǒng)已被國際分析化學協(xié)會(AOAC)列為法定分析法。利用微生物生化反應的原理把30 個對細菌鑒定必需的生化反應培養(yǎng)基固定到卡片上，然后通過培養(yǎng)后儀器對顯色反應進行判斷，利用數值法進行判定。在檢測前同樣進行常規(guī)的篩選培養(yǎng)，必要時需結合血清學實驗進行最后鑒定。

2.4 生物傳感器檢測

生物傳感器是結合了生物感受器和物理或化學換能器的一項新技術，可以快速檢測少量的活性生物分子。它能滿足食品中病原微生物靈敏、實時檢測的要求，目前對食品中單核細胞增多性李斯特菌的檢測方面有了一些研究。

武會娟等［29］應用F0F1-ATP 酶旋轉分子馬達和免疫技術相結合，建立免疫生物傳感器快速檢測技術。首先pH 變化敏感熒光物質F1300 標記到色素體的內表面，然后在F0F1-ATP 酶上連接β 亞基抗體-生物素-鏈親和素-生物素-單核細胞增多性李斯特菌多抗復合體，得到可以捕獲單核細胞增多性李斯特菌的免疫生物傳感器。傳感器上負載菌量不同，酶活性不同，酶活變化以pH 敏感的熒光探針來感應，最后通過熒光掃描儀檢測不同菌量負載下的熒光信號。結果表明，該方法對單核細胞增生李斯特菌標準菌株(ATCC 15313)的檢測時間為4.5h，檢出濃度為100cfu/孔。

目前的幾種快速檢測方法除了ELISA 法應用于實際檢測外，分子生物學方法大多數用于科研。我國目前對鮮活農產品中單核細胞增多性李斯特菌的檢測主要采用分離培養(yǎng)方法結合相關的顯色培養(yǎng)基和VITEK 系統(tǒng)進行檢測，整個操作過程較復雜，檢測時間大多在2～3d，尚無法滿足對鮮活農產品的實時檢測需要。因此開發(fā)一種快速、靈敏、簡潔、價廉的檢測方法是目前一個研究重點。

3 展望

以上綜述了鮮活農產品中基于分子生物學、免疫學等技術的單核細胞增多性李斯特菌現階段幾種快速檢測手段，然而這些方法與傳統(tǒng)的檢測方法比較準確性、靈敏度、檢測效率較低;成本較高。且還有很多方法尚停留在實驗室階段，未推廣到實踐中應用。但是隨著科學的發(fā)展，分子生物學、免疫學、物理手段等的深入研究，對原有技術進行改進，多種相關技術聯(lián)用，以及不斷地運用一些新的其他領域的技術到單核細胞增多性李斯特菌的檢測中，相信在不久的將來，一定會研制出合適于鮮活農產品中單核細胞增多性李斯特菌的高效、便捷、靈敏、低廉的快速檢測技術。

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