小反芻獸疫診斷技術(shù)及其疫苗研究進(jìn)展

楊翠玲

（濰坊市經(jīng)濟(jì)學(xué)校，山東 諸城 262200）

小反芻獸疫（PPR）是一種嚴(yán)重的烈性、接觸性傳染病。FAO/OIE規(guī)定PPR為A類烈性傳染病，我國規(guī)定為一類動物疫病。其病原是小反芻獸疫病毒（PPRV），其與牛瘟病毒（RPV）同屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，PPRV曾被錯誤的認(rèn)為是RPV的變異株，二者能產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)作用，因此常用牛瘟疫苗預(yù)防PPR，直到20世紀(jì)70年代后期才證明PPRV不同于RPV。

PPRV主要感染小反芻獸，山羊高度易感，不同品種的山羊易感性不同，歐洲品系的山羊更易感，幼齡動物易感性較高，哺乳期的動物抵抗力較強(qiáng)；豬和牛也可感染，但通常無臨床癥狀，通過調(diào)查PPR的流行過程，牛、豬及昆蟲在傳播該病過程中未起到作用；瞪羚、努比亞野山羊、東方盤羊及長角羚有死亡的報道；另外證實(shí)PPRV可以克服大型反芻動物的先天抵抗力，感染駱駝、水牛等反芻動物[1-3]。自然感染PPRV后，典型臨床特征是高熱（41℃）、流淚、眼鼻分泌物增多、嚴(yán)重腹瀉、口舌潰瘍、支氣管肺炎，嚴(yán)重感染時發(fā)病率和病死率都可以達(dá)到100%。目前該病主要通過早期診斷和疫苗免疫的方式進(jìn)行控制[4]。

世界上第一例PPR于1942年發(fā)生在非洲的科特迪瓦，本病曾經(jīng)給非洲、中東等地區(qū)的小反芻動物養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重災(zāi)害。到2006年初，我國周邊國家孟加拉國、尼泊爾、印度、巴基斯坦等先后暴發(fā)PPR疫情，近幾年呈現(xiàn)蔓延趨勢。2007年7月我國首例小反芻獸疫疫情在西藏發(fā)生，并經(jīng)國家外來動物疫病診斷中心確診，作為一種動物外來疫病，該病已嚴(yán)重威脅到我國小反芻獸的健康，因此對該病開展研究具有重要意義[5]。

1 診斷技術(shù)

PPR的確診須依賴于實(shí)驗(yàn)室檢測，目前實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有9種。

1.1 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗(yàn)在臨床中廣泛應(yīng)用，該方法簡單、便宜，可在基層實(shí)驗(yàn)室甚至野外操作，反應(yīng)18～24 h可獲得結(jié)果。但對于臨床中比較常見的溫和型PPR來講，AGID試驗(yàn)的敏感性不足以檢測到分泌物中含量較低的抗原，故不適用于PPR的早期診斷。

1.2 對流免疫電泳

學(xué)者用對流免疫電泳（CIEP）和AGID兩種檢測方法同時檢測PPR病料，CIEP可以檢測到80.3%的陽性率，而AGID的檢測陽性率是42.6%，說明CIEP的敏感性較高。Osman等用CIEP及競爭ELISA（c-ELISA）兩種方法同時檢測519個血清樣本，CIEP的陽性率是59.15%，c-ELISA的陽性率為50.67%，說明CIEP的敏感性高于c-ELISA，但是CIEP試驗(yàn)的缺點(diǎn)是不能區(qū)別RPV感染[6]。鑒于CIEP較高的敏感性，因此在無條件進(jìn)行c-ELISA的地區(qū)或者實(shí)驗(yàn)室，CIEP可作為一種有用的篩選試驗(yàn)，用于PPRV的臨床檢測。

1.3 間接熒光抗體試驗(yàn)

學(xué)者通過PPRV的單克隆抗體建立間接熒光抗體試驗(yàn)（IFAT），能特異性地檢測出早期及晚期病料中的PPRV。另外，以重組PPRV F蛋白為抗原，免疫家兔，制備其多克隆抗體，以制備的多克隆抗體為一抗，用于捕獲病料中的抗原，以羊抗兔的IgG作為二抗，通過IFAT能特異性的診斷出PPRV[7]。

1.4 病毒分離鑒定

PPRV的培養(yǎng)分離可以選用原代羔羊腎細(xì)胞及非洲綠猴腎細(xì)胞。培養(yǎng)5～6 d后，細(xì)胞變圓、收縮，最終形成合胞體，其細(xì)胞核呈圓形，猶如表盤狀排列；因CPE出現(xiàn)時間較晚，5～6 d后應(yīng)進(jìn)行盲傳繼代，進(jìn)一步鑒定需要借助病毒中和試驗(yàn)（VNT）或電子顯微鏡[8]。由于其試驗(yàn)要求較高，需要大量人力物力，不利于基層實(shí)驗(yàn)室開展檢測工作。

1.5 中和試驗(yàn)

在國際貿(mào)易中，中和試驗(yàn)（VNT）是PPR指定診斷方法，該方法靈敏、特異，但是通常需要10～12 d，試驗(yàn)要求較高，不適合大規(guī)模樣品檢測。其轉(zhuǎn)管培養(yǎng)通常在原代羔羊腎細(xì)胞或者非洲綠猴腎細(xì)胞進(jìn)行，通過與RPV進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，可以與RPV進(jìn)行鑒別診斷[9]。

1.6 ELISA

應(yīng)用ELISA方法監(jiān)測血清的方法已經(jīng)十分成熟，而且有多種試驗(yàn)方法。

1.6.1 競爭ELISA

動物感染PPRV后，其血清中抗體一部分是針對PPRV N蛋白和H蛋白的，基于其單克隆抗體建立c-ELISA檢測方法[8]。另外，將RPV碳端可變區(qū)在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，用作c-ELISA抗原，鑒別診斷RPV和PPRV感染。c-ELISA是OIE的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法之一，現(xiàn)已開發(fā)出標(biāo)準(zhǔn)c-ELISA檢測試劑盒，用于檢測血清或者血漿中的PPRV N蛋白抗體。此方法耗時較短，能實(shí)現(xiàn)檢測的大量化，敏感性為94.5%、特異性為99.4%，與經(jīng)典的病毒中和試驗(yàn)具有較高的相關(guān)性，因此得到廣泛應(yīng)用。

1.6.2 夾心ELISA

夾心ELISA（S-ELISA）方法的原理是用多克隆抗體捕獲臨床樣品中的PPRV抗原，用針對PPRV N蛋白的單克隆抗體檢測捕獲的抗原。Singh等試驗(yàn)表明，S-ELISA特異性達(dá)92.8%，敏感性達(dá)88.9%，2 h內(nèi)可獲得試驗(yàn)結(jié)果，特別適合臨床樣品的檢測，缺點(diǎn)是不能鑒別診斷RPV；另外由于S-ELISA具有迅速、簡單的特點(diǎn)，因此可替代VNT，用于PPR疫苗質(zhì)量控制[10]。

1.6.3 間接ELISA

基于血清中的多抗，Balamurugan等建立了間接ELISA（i-ELISA）方法，特異性和敏感性分別達(dá)95.09%及90.81%。Zhang等克隆了在中國西藏爆發(fā)的PPRV N蛋白基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，以此建立i-ELISA方法，分析697份血清表明，敏感性和特異性分別是96.7%及96.1%[11]。分析比對發(fā)現(xiàn)，PPRV NP蛋白的452-472位區(qū)域的多肽序列是PPRV特異的，并且具有較強(qiáng)的免疫原性，其產(chǎn)生的抗體能特異地識別PPRV，因此可以鑒別診斷PPRV及RPV。鑒于其較高特異性及敏感性，因此i-ELISA方法可以取代國外昂貴的試劑盒用于PPR的實(shí)驗(yàn)室診斷。

1.7 核酸探針雜交試驗(yàn)

目前已克隆出PPRV各個基因，并建立了核酸探針雜交檢測方法。針對PPRV N蛋白基因的cD?NA探針可以鑒別診斷PPRV及RPV，由于32P的半衰期較短以及放射性元素危害較大等原因，核酸探針雜交試驗(yàn)成為一種常規(guī)診斷方法不太現(xiàn)實(shí)。

1.8 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

Balamurugan等建立了針對N、M基因的一步法多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法（RT-PCR），可鑒別診斷RPV[12]?；赑PRV N、H、M蛋白基因，Georg等建立了多重RT-PCR方法，研究證實(shí)M基因的PCR敏感性最高，N、H及F基因依次次之，可以鑒別診斷PPRV和RPV；基于PPRV N蛋白基因，建立了一步法實(shí)時定量RT-PCR法，能夠檢測血液樣本，與常規(guī)RT-PCR相比，具有敏感性更高且減少PCR污染的優(yōu)勢[13]。鑒于PCR快速、特異、靈敏、高通量的優(yōu)勢，PCR檢測方法在PPRV的診斷中將發(fā)揮重大優(yōu)勢。

1.9 PCR-ELISA

基于PPRV N基因，Saravana等建立了PCRELISA檢測方法，通過RT-PCR擴(kuò)增地高辛標(biāo)記的336 bp產(chǎn)物，然后通過ELISA檢測，該方法靈敏度比傳統(tǒng)RT-PCR高10 000倍，在對臨床樣本的檢測中，其敏感性高于S-ELISA[14]。因此該方法比S-ELISA更適用于早期感染及感染后期的檢測，同時能進(jìn)行PPRV與RPV的鑒別診斷。

2 疫苗研究進(jìn)展

2.1 RPV弱毒疫苗

RPV弱毒疫苗曾在西非廣泛應(yīng)用于綿羊和山羊的免疫，不但可以控制RP，又可以預(yù)防PPR，免疫保護(hù)效果較好，其原因是PPRV與RPV具有較高的抗原相關(guān)性。但是該疫苗不利于RP的無疫認(rèn)證。Walsh等將綠色熒光蛋白（GFP）基因插入牛瘟弱毒RBOK疫苗株，構(gòu)建成重組病毒RPV?SIG-GFP，免疫接種后，RPV和PPRV的強(qiáng)毒均不能使其感染，其產(chǎn)生的抗GFP抗體可用于區(qū)別自然感染和疫苗免疫動物[15]。

2.2 PPR弱毒疫苗

20世紀(jì)80年代末，PPRV毒株在非洲綠猴腎細(xì)胞成功致弱，該株疫苗屬于Ⅰ群，但是交叉保護(hù)作用較強(qiáng)，無任何毒副作用，因此廣泛用于PPR的預(yù)防；通過冷凍干燥可極大提高其熱穩(wěn)定性，利于基層運(yùn)輸及使用；免疫后，保護(hù)性抗體可維持12個月，母源抗體較高，可在4月或者5月齡首免；缺點(diǎn)是不能區(qū)分野毒及疫苗毒[16]。另外，Rashid將巴基斯坦當(dāng)?shù)氐腜PRV毒株經(jīng)細(xì)胞致弱后，免疫山羊及綿羊21 d后，采用c-ELISA方法，可以檢測到較高水平的抗體，抗體可以維持1年[17]。

2.3 PPR滅活疫苗

同源的PPR滅活疫苗通常使用感染PPRV山羊的病理組織進(jìn)行制備，研究表明，氯仿的滅活效果優(yōu)于甲醛，用氯仿滅活后免疫動物，血清抗體可持續(xù)8個月，但是無法區(qū)分野毒株和疫苗株。

2.4 重組亞單位疫苗

用純化的重組桿狀病毒表達(dá)的HN蛋白具有良好的免疫原性，無需使用佐劑，低劑量免疫山羊后，能產(chǎn)生中和PPRV和RPV的抗體。通過原核表達(dá)PPRV和RPV的NP蛋白，經(jīng)過純化，單劑量、無需佐劑的前提下免疫小鼠即可產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Khandelwal等表達(dá)PPRV HN蛋白，其免疫表位具有天然構(gòu)象，綿羊口服后，能產(chǎn)生中和抗體，且能使細(xì)胞介導(dǎo)其免疫反應(yīng)[18]。與PPR弱毒疫苗相比較，重組亞單位疫苗耐熱性能穩(wěn)定，且持續(xù)時間比較長，因此在PPR防控中占有極大優(yōu)勢。

2.5 嵌合體疫苗

利用PPRV的F和H、M蛋白基因代替RPV疫苗基因組中的對應(yīng)基因，可以是單獨(dú)代替也可以是同時代替，以此構(gòu)建嵌合體疫苗。研究表明，嵌合體疫苗RPV-PPRFH在組織中繁殖不良，相反的RPV-PPRMFH的繁殖速度得到提升；免疫山羊后，山羊無不良反應(yīng)，能產(chǎn)生較高的中和抗體，抵抗PPRV強(qiáng)毒的攻擊[19]。可見RPV-PPRMFH是一個良好的候選嵌合體疫苗。

2.6 山羊痘活載體疫苗

預(yù)防羊痘與小反芻獸疫的疫苗均為弱毒疫苗，存在散毒隱患。重組羊痘病毒（rCPV）免疫后既可以抵抗PPR的感染，同時也能預(yù)防CPV的感染。Chen等成功將PPRV的F基因或者H基因插入羊痘病毒的TK基因編碼區(qū)，構(gòu)建了重組病毒rCPV-PPRVH及rCPV-PPRVF，研究證實(shí)與rCPVPPRVF相比rCPV-PPRVH能產(chǎn)生更強(qiáng)的誘導(dǎo)免疫，免疫注射1次后，就可以使80%的羊產(chǎn)生抗體，免疫6個月后仍能檢測到中和抗體[20]。因此，重組羊痘疫苗是小反芻獸疫疫苗新的發(fā)展方向。

2.7 RNA干涉技術(shù)

通過利用重組腺病毒及桿狀病毒載體表達(dá)小干擾RNA（SiRNA），用于治療PPRV及RPV感染，重組病毒可以抑制＞73%的病毒復(fù)制，結(jié)果表明，SiRNA分子在對抗麻疹病毒感染治療中具有潛在價值[21]。因此，RNA干涉技術(shù)可以克服通常疫苗誘導(dǎo)期長的缺點(diǎn)，有望作為一種有效的抗病毒治療制劑應(yīng)用于控制PPRV感染。

3 小結(jié)

PCR和c-ELISA檢測技術(shù)具有快速、特異、靈敏、高通量性的特性，因此成為OIE規(guī)定的檢測標(biāo)準(zhǔn)方法，而基因工程疫苗將在控制小反芻獸疫中發(fā)揮重要的作用。

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