銅綠假單胞菌生物膜形成與眼部感染

陳薇嬰綜述，關(guān)禹博審校

(天津市眼科醫(yī)院天津市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點實驗室天津醫(yī)科大學(xué)眼科臨床學(xué)院檢驗科，天津300020)

銅綠假單胞菌生物膜形成與眼部感染

陳薇嬰綜述，關(guān)禹博審校

(天津市眼科醫(yī)院天津市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點實驗室天津醫(yī)科大學(xué)眼科臨床學(xué)院檢驗科，天津300020)

銅綠假單胞菌；生物膜；眼病

銅綠假單胞菌(PA)廣泛分布于自然界、醫(yī)院環(huán)境、醫(yī)療器械以及人類正常皮膚、腸道、呼吸道等，是極為常見的條件致病菌，是院內(nèi)感染的主要致病菌之一。銅綠假單胞菌引起的一些遷延不愈的慢性感染性疾病與其在感染部位形成生物膜(biofilm,BF)有關(guān)。同樣，一些眼部感染性疾病或一些生物材料植入而導(dǎo)致的并發(fā)癥，也常常是因為感染了產(chǎn)生物膜的菌株，尤以產(chǎn)生物膜的銅綠假單胞菌為主，由于生物膜的產(chǎn)生使得該菌耐藥性增強，從而導(dǎo)致治療困難。

1 銅綠假單胞菌生物膜的形成

1.1 銅綠假單胞菌生物膜的形成過程細菌在自然界一般以浮游或聚集狀態(tài)存在，但99%是以聚集狀態(tài)即形成生物膜的方式侵入人體[1]，易在生物醫(yī)學(xué)材料或機體黏膜上聚集，以抵御吞噬細胞的吞噬和機體的免疫系統(tǒng)。

銅綠假單胞菌侵入人體后，首先借助于鞭毛到達可黏附物表面并在其形成單層菌落，最初為可逆性黏附，后發(fā)展為不可逆黏附，隨后在菌毛的作用下在黏附表面形成微菌落并最終形成成熟的生物膜[2]。

1.2 銅綠假單胞菌生物膜的分子結(jié)構(gòu)銅綠假單胞菌侵入人體后即突變?yōu)轲ひ褐?，其自身分泌大量的胞外多糖并包裹細菌形成生物膜的主要成分，藻酸鹽是胞外多糖的主要成分[3，4]，生物膜還含有細菌分泌的各種主要的生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物質(zhì)。

1.3 銅綠假單胞菌生物膜形成的觀察

1.3.1 染色法銀染法一般是采用硅膠、聚氯乙烯或玻片等作為生物膜載體[5]，用5%AgNO3溶液染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察生物膜的形成。通過銀染法發(fā)現(xiàn)[6]對照組鏡檢僅見散在的黑點或黑斑，細菌培養(yǎng)7d后黑染部分形成棉絮樣的膜狀物，說明有生物膜形成。

使用剛果紅-阿利新藍(AB)染液聯(lián)合胞外多糖染色，細菌細胞呈淡紅色，胞外多糖呈深紫紅色，用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)形成生物膜的細菌緊密堆積且邊緣不清晰，胞外多糖聚集成團圍繞在菌體周圍[7]。

染色法的優(yōu)點是試驗條件要求不高，試劑價格低廉，敏感性較好，但操作較繁瑣且實驗周期較長，有時可能影響生物膜的完整結(jié)構(gòu)。

1.3.2 激光共聚焦顯微鏡銅綠假單胞菌的生物膜分別用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的刀豆蛋白A (FITC-ConA)和碘化吡啶(PI)進行免疫熒光染色，由于FITC-ConA與生物膜的胞外多糖結(jié)合可發(fā)出綠色熒光，PI可以和細菌的DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光，因此可在激光共聚焦顯微鏡下對生物膜的形成進行動態(tài)觀察。使用蓋玻片生物膜培養(yǎng)法觀察發(fā)現(xiàn)[8]，在最初的16h，細菌無多糖產(chǎn)生，24h后細菌不斷聚集并開始大量產(chǎn)生多糖，生物膜初步形成，72h后生物膜基本分化成熟。該方法對細菌及其生物膜無損傷，可直接觀察生物膜形成的動態(tài)過程，并且可以對生物膜的各種指標如生物膜的厚度、均一性、比表面積、各種熒光的強度等多個參數(shù)進行量化，是目前較為理想的生物膜檢測方法[9]。

2 銅綠假單胞菌生物膜形成的調(diào)節(jié)機制

群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)是指當(dāng)細菌的數(shù)量達到一定密度(quorum)時才發(fā)生感應(yīng)現(xiàn)象(sensing)。目前研究發(fā)現(xiàn)，與PA生物膜相關(guān)的QS系統(tǒng)是las系統(tǒng)和Rh1系統(tǒng)[10,11]。Las系統(tǒng)由lasR和lasI基因組成，Rh1系統(tǒng)則包含rh1R和rh1I基因，las系統(tǒng)表達的信號分子為N-乙酰-高絲氨酸內(nèi)酯, Rh1系統(tǒng)表達的信號分子是N-丁酰-高絲氨酸內(nèi)酯，細菌在生長過程中可通過信號分子控制BF的發(fā)展成熟,并協(xié)調(diào)整個細菌群體行為,共同對周圍環(huán)境刺激做出反應(yīng),增強整個細菌群體的生存能力。

一般情況下,銅綠假單胞菌侵入人體后72h即可形成較厚、分化良好、有孔狀通道的生物膜結(jié)構(gòu)。但研究發(fā)現(xiàn)[12]lasR基因缺陷型所形成的生物膜結(jié)構(gòu)松散且發(fā)育遲緩，而rhlR基因缺陷型細菌則不能形成明顯的生物膜。應(yīng)用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)分子，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染成熟的生物膜，干擾銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的lasR、rhlR和rhll三個關(guān)鍵性基因，可以促進生物膜解體[13]。

鎂離子等金屬二價陽離子與細菌多糖及玻片載體所攜帶的負電荷互相吸引，有利于細菌相互聚集及與載體的吸附，因而有利于生物膜的形成。鎂離子可以增加BF多糖的產(chǎn)生或者減少多糖的降解，使生物膜的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，更能抵御抗生素的作用[14]。

銅綠假單胞菌的鞭毛的推動力在生物膜形成的早期細菌黏附階段起重要作用，合成鞭毛的基因有40余種，其中最重要的是motA基因，它在生物膜的發(fā)展形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[15]。

3 銅綠假單胞菌生物膜與眼科疾病

銅綠假單胞菌并非眼表的共生菌，不能定居于眼表，然而角膜接觸鏡為暫住的細菌提供了黏附表面，其在接觸鏡表面可形成生物膜，成熟的生物膜可間歇地釋放細菌以及細菌產(chǎn)物，如內(nèi)毒素或外毒素等損傷角膜上皮，從而導(dǎo)致角膜炎的發(fā)生[16]。與此同時，銅綠假單胞菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶、明膠酶，以及其侵入角膜上皮的能力對此類角膜炎的發(fā)病亦起了重要作用[17]。

目前全球約有上億的隱形眼鏡佩戴者。在全球市場中，為延長配戴時間，多使用硅水凝膠鏡片作為主要隱形眼鏡鏡片類型。然而，這些高分子材料的引入也沒有解決由其導(dǎo)致的眼部感染和炎癥問題，細菌性角膜炎的發(fā)病率并沒有改變[18]。銅綠假單胞菌是配戴隱形眼鏡引起細菌性角膜炎的主要致病菌，該菌有附著隱形眼鏡并隨后形成生物膜的能力，該生物膜延長了病原體與眼睛的表面接觸，提高了其致病性[19,20]。

眼內(nèi)炎是眼外傷或眼部手術(shù)如白內(nèi)障等的常見并發(fā)癥，細菌進入眼組織后可形成生物膜，對滴眼劑的耐藥性增強，并能抵御機體免疫系統(tǒng)對細菌的清除作用。

4 抑制銅綠假單胞菌生物膜形成的研究進展

眼部微生物膜形成后對各類抗生素滴眼液及眼膏的耐藥性增強，且易抵抗機體免疫系統(tǒng)對微生物的清除。目前，針對一些抑制生物膜形成的藥物的研究受到廣泛重視，研究顯示[21]，大環(huán)內(nèi)酯類藥物克拉霉素與氟喹諾酮類藥物加替沙星聯(lián)用可有效清除大鼠肺部PA生物膜感染。具有抗菌作用的中藥雙黃連溶液與加替沙星聯(lián)用對PA生物膜有明顯抑制作用，而且兩藥有明顯的協(xié)同作用[22]。此外，祛痰藥鹽酸氨溴索與阿米卡星聯(lián)用，增強了阿米卡星對生物膜內(nèi)PA的殺菌作用[23]。納米銀能阻礙銅綠假單胞菌和表皮葡萄球菌生物膜的形成[24]。研究顯示[25]，環(huán)丙沙星、慶大霉素及氨芐西林單獨應(yīng)用對生物膜的清除效果有限，EDTA對生物膜有一定清除作用，當(dāng)EDTA與抗生素聯(lián)合作用時則對生物膜有顯著殺菌作用，這是因為EDTA可以和細菌細胞外膜的脂多糖上的鎂離子結(jié)合，促進脂多糖釋放，從而增加細胞膜的通透性，有利于抗菌藥滲入胞內(nèi)發(fā)揮作用。這將有助于改變臨床上銅綠假單胞菌對多種抗生素的耐藥情況。

最近的研究表明[26]，噬菌體能產(chǎn)生多糖解聚酶降解細菌胞外多糖，4種銅綠假單胞菌敏感藥物(慶大霉素、環(huán)丙沙星、加替沙星、頭孢他啶)對經(jīng)噬菌體作用后的銅綠假單胞菌的敏感度均有不同程度的提高，說明噬菌體產(chǎn)生的多糖解聚酶有利于抗菌素通透細菌的生物膜，有協(xié)同抗菌作用。

對銅綠假單胞菌生物膜的生物學(xué)研究將有助于對眼部感染和眼部非生物性材料植入導(dǎo)致的細菌感染提供新的治療方法。

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R446.5,R378.99+1

A

1674-1129(2013)05-0471-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.026

陳薇嬰，女，漢族，1966年5月23日出生，畢業(yè)于天津醫(yī)科大學(xué)檢驗系，學(xué)士學(xué)位，主管技師，主要研究方向為眼科微生物感染。

關(guān)禹博，男，漢族，1965年6月18日出生，畢業(yè)于天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療系,學(xué)士學(xué)位，副主任醫(yī)師，主要研究方向為視網(wǎng)膜脫離及眼底病。