缺血再灌注對(duì)大鼠睪丸腦紅蛋白表達(dá)的影響

徐國(guó)輝，楊文濤，馬書玲，秦豪杰

精索靜脈曲張和睪丸扭轉(zhuǎn)等是影響男性生殖健康、導(dǎo)致男性不育的常見原因，臨床上不管是進(jìn)行積極的外科治療還是保守治療，總有一部分病例發(fā)生睪丸萎縮、血清睪酮水平下降、精子功能低下等不良后果[1-3]。究其原因，除缺血缺氧性損傷外，恢復(fù)血供后組織中產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的損害作用也是一不可忽視的因素[4，5]。腦紅蛋白(neuroglobin, NGB)是主要在脊椎動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的攜氧球蛋白，有對(duì)抗組織細(xì)胞缺氧和清除氧自由基的作用[6，7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，NGB在成年男性生殖系統(tǒng)特別是睪丸組織內(nèi)有廣泛分布[8]，認(rèn)為其可能對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持及生殖內(nèi)分泌功能的發(fā)揮有一定的積極意義。為了探討NGB在睪丸缺血再灌注損傷后的表達(dá)變化及意義，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)對(duì)NGB在大鼠睪丸組織缺血再灌注后的表達(dá)變化水平進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物模型及取材健康雄性SD大鼠48只(體質(zhì)量200～250 g)，購(gòu)自河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(分6個(gè)時(shí)間組)、假手術(shù)組和正常對(duì)照組，每小組6只。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔麻醉(2%戊巴比妥鈉，50 mg/kg)后取左下腹切口，暴露左側(cè)睪丸動(dòng)脈，血管夾夾閉15 min后去除血管夾并縫合切口，假手術(shù)組采用相同操作但不夾閉睪丸動(dòng)脈。分別于再灌注后3、6、12、24、48、96 h斷頸處死大鼠，提取睪丸并沿橫軸切開，1份甲醛固定用于組織切片制作，1份用于總RNA及總蛋白提取。

1.2組織切片制作及觀察組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、切片后行HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并照相。

1.3mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

1.3.1睪丸總RNA提取 按RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa公司)說明書進(jìn)行。NanoDrop 1000測(cè)定RNA濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA提取質(zhì)量。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2引物設(shè)計(jì)與合成 引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成。NGB引物序列為：5′-GGGCTCCTCCTGTCACCTTAC-3′(forward)，5′-TCCCACTCTATTTGCTCTCGC-3′(reverse)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度157 bp。內(nèi)參18S rRNA引物序列為：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′(forward)，5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′(reverse)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度151 bp。

1.3.3RNA逆轉(zhuǎn)錄及常規(guī)PCR檢測(cè)目的基因擴(kuò)增片段 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)ermentas公司)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。將cDNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增(PCR Master Mix，F(xiàn)ermentas公司)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其特異性并送生物公司測(cè)序正確后進(jìn)行下述操作。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法) 將正常對(duì)照組的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)核酸純化試劑盒(DNA Fragment Purification Kit，TaKaRa公司)純化后，按101、102、103、104、105、106倍進(jìn)行倍比稀釋，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。按定量PCR試劑盒(Maxima?SYBR Green qPCR Master Mix，F(xiàn)ermentas公司)說明書配制反應(yīng)體系，25 μL體系內(nèi)含：2×SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、ROX Solution 0.05 μL、Template DNA 1 μL。每個(gè)樣品設(shè)置三管復(fù)孔。PCR參數(shù)：95℃ 10 min預(yù)變性；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果由熒光定量分析儀(Applied Biosystems 7500)自動(dòng)采集。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行融解曲線分析，判斷產(chǎn)物的特異性。

1.4蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)RIPA裂解法提取組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并調(diào)整一致，取等量樣品加上樣buffer后煮沸10 min變性，各取10 μl行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)后按分子量大小剪開，分別小鼠抗人NGB單克隆抗體(1∶500，Abcam)、小鼠抗人beta aictin單克隆抗體(1∶1000，中杉金橋)4℃孵育過夜，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，加入U(xiǎn)ltraECL底物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(百泰克)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測(cè)拍照，條帶光密度值運(yùn)用Image-Pro Plus 5.1軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組和假手術(shù)組睪丸組織細(xì)胞形態(tài)良好，兩者未見明顯差別。缺血再灌注后，睪丸生精細(xì)胞水腫，細(xì)胞周隙明顯增寬，至96 h后可見生精細(xì)胞層數(shù)減少，排列紊亂，管腔內(nèi)精子細(xì)胞減少。

2.2NGBmRNA表達(dá)變化NGB及18S融解曲線均為單峰，無(wú)引物二聚體及非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。二者標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率分別為-3.442和-3.607，相關(guān)系數(shù)分別為0.997和0.996。根據(jù)擴(kuò)增效率計(jì)算公式E=10[-1/slope]-1(E為擴(kuò)增效率，slope為斜率)，得到的擴(kuò)增效率E分別為0.952和0.893，在理想范圍(0.8

2.3NGB蛋白表達(dá)變化Western blot檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后NGB表達(dá)逐漸升高，于12 h達(dá)高峰，其中6、12和96 h組與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

精索靜脈曲張和睪丸扭轉(zhuǎn)對(duì)睪丸損害的實(shí)質(zhì)是缺血缺氧性損傷，然而外科手術(shù)或復(fù)位后的血液再灌注對(duì)局部組織細(xì)胞亦有一定的損傷作用，這可能是導(dǎo)致部分患者不育的原因之一[1-5]。因此睪丸缺血再灌注損傷機(jī)制及防護(hù)措施的研究一直備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用睪丸動(dòng)脈夾閉法制作睪丸缺血再灌注損傷模型，可以更準(zhǔn)確地控制睪丸缺血程度，減少實(shí)驗(yàn)對(duì)象之間的差異。而且，此方法較精索靜脈曲張模型和睪丸扭轉(zhuǎn)模型操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性更強(qiáng)，對(duì)單純的睪丸缺血再灌注損傷病理改變及機(jī)制方面研究來說，不失為一種簡(jiǎn)單有效的方法。

目前對(duì)NGB的研究主要集中在缺血缺氧性腦損傷及相關(guān)疾病方面，認(rèn)為它可能通過攜氧、貯氧和氧感受器功能，NADH氧化酶作用，以及ROS和NO基團(tuán)清道夫等功能，對(duì)腦缺血缺氧性損傷起到保護(hù)作用[6，7，9，10]。

正常情況下機(jī)體氧自由基的產(chǎn)生、利用和清除之間處于一種動(dòng)態(tài)平衡。但在睪丸缺血/再灌注時(shí)，ROS產(chǎn)生過多，使睪丸處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，組織細(xì)胞損傷，生精細(xì)胞凋亡增加[11，12]。因此，及時(shí)清除過多ROS的損害作用，提高睪丸組織的缺血缺氧耐受能力，將會(huì)減輕上述疾病和損傷的睪丸損害作用，從而改善預(yù)后，減少男性不育的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)顯示NGB于睪丸缺血再灌注后表達(dá)升高，特別是6～12 h升高最為顯著，鑒于NGB的前述功能作用，NGB可能在睪丸抗缺血再灌注損傷方面有一定的積極意義，并有可能作為精索靜脈曲張和睪丸扭轉(zhuǎn)等疾病的康復(fù)輔助治療的新靶點(diǎn)。不過，其具體效果及機(jī)制仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Baazeem A,Belzile E,Ciampi A,et al.Varicocele and male factor infertility treatment: A new meta-analysis and review of the role of varicocele repair[J].Eur Urol, 2011, 60: 796-808.

[2]Romeo C,Impellizzeri P,Arrigo T,et al.Late hormonal function after testicular torsion[J].J Pediatr Surg,2010, 45:411-413.

[3]Kanter M.Protective effects of Ginkgo biloba (EGb 761) on testicular torsion/detorsioninduced ischemia-reperfusion injury in rats[J].Exp Mol Pathol,2011,91:708-713.

[4]Wei SM,Yan ZZ,Zhou J.Psoralea corylifolia protects against testicular torsion/detorsion-induced ischemia/reperfusion injury[J].J Ethnopharmacology, 2011,137:568-574.

[5]Benoff S,Marmar JL,Hurley IR.Molecular and other predictors for infertility in patients with varicoceles [J].Front Biosci,2009,14:3641-3672.

[6]Burmester T,Hankeln T,What is the function of neuroglobin?[J].J Exp Biol,2009,212:2423-2428.

[7]Li RC, Guo SZ,Lee SK,Gozal D.Neuroglobin protects neurons against oxidative stress in global ischemia [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2010, 30(11):1874-1882.

[8]秦豪杰，武娜，張錄順，等.腦紅蛋白在成年男性生殖系統(tǒng)的表達(dá)及意義[J].解剖學(xué)雜志，2008，31(3)：348-350.

[9]Brittain T, Skommer J, Henty K, et al. A role for human neuroglobin in apoptosis [J]. IUBMB Life, 2010, 62(12): 878-885.

[10]Lee HM,Greeley GH Jr,Englander EW.Transgenic overexpression of neuroglobin attenuates formation of smoke-inhalation-induced oxidative DNA damage, in vivo, in the mouse brain[J].Free Radic Biol Med, 2011, 51(12): 2281-2287.

[11]Yurtcu M,Abasiyanik A,Bicer S,Avunduk MC.Efficacy of antioxidant treatment in the prevention of testicular atrophy in experimental testicular torsion[J].J Pediatr Surg,2009,44:1754-1758.

[12]Lombardo F,Sansone A,Romanelli F,et al.The role of antioxidant therapy in the treatment of male infertility: an overview [J].Asian J Androl,2011,13(5):690-697.