羊棲菜急性毒性實(shí)驗(yàn)及體外抑菌活性的研究

錢媛華，楊靖亞，孫立春，王燕萍，王 珍

（上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306）

羊棲菜[Sargassum fusiforme（Harv.） Setchel]屬褐藻門馬尾藻科，藻體黃褐色，多分布于我國(guó)沿海，素有“長(zhǎng)壽菜”、“餐桌上的海人參”之美譽(yù)，在中國(guó)古代，人們有用海藻羊棲菜入藥的習(xí)慣，南齊陶弘景的《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]及李時(shí)珍的《本草綱目》[2]均有記載?，F(xiàn)代研究也表明羊棲菜具有降血壓、降血脂、抑菌、消除放射性物質(zhì)危害、防癌抗癌和減肥美容等功效[3-5]。羊棲菜水提物的成分比較復(fù)雜，但現(xiàn)已基本確定其有效成分主要是羊棲菜多糖（Sargassum FusifomePolysaccharides，SFPs），一種水溶性多糖，主要以褐藻酸、褐藻糖膠和褐藻淀粉的形式存在，具有復(fù)雜的多方面的生物活性與功能特點(diǎn)，且為非細(xì)胞毒性物質(zhì)，其中，硫酸根的含量與多糖的生物活性具有密切關(guān)系[6-7]。雖然羊棲菜有極高的食用和藥用價(jià)值，但由于其特殊的砷富集作用（世界衛(wèi)生組織下屬國(guó)際癌癥研究組織已把砷列為致癌物），使得其全藻中砷含量嚴(yán)重超標(biāo)，讓很多國(guó)家和地區(qū)對(duì)其敬而遠(yuǎn)之。到目前為止，尚未有對(duì)羊棲菜全藻及水提物的可食用性及抑菌活性進(jìn)行的報(bào)道。針對(duì)沿海地區(qū)人們熱衷于食用羊棲菜全藻，以及國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上出現(xiàn)的以羊棲菜水提物為主料的保健飲料，本實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)了羊棲菜全組分及水提物中多糖、硫酸根、總砷及無(wú)機(jī)砷含量，對(duì)羊棲菜的急性毒性及體外抑菌活性進(jìn)行了考察，為探究羊棲菜的食用安全性及開發(fā)利用性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜 購(gòu)自浙江洞頭農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雌雄各半，由上海復(fù)旦大學(xué)提供，合格證號(hào)SCXK（滬）2009-0019；變異鏈球菌 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院齲病研究室惠贈(zèng)；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院微生物培養(yǎng)室；腦心浸液（BHI）液體/固體培養(yǎng)基 購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA） 購(gòu)自上?？禎?rùn)生物科技有限公司；濃鹽酸、明膠、氯化鋇、硫酸鉀、三氯乙酸、苯酚、濃硫酸、葡萄糖等試劑 均為分析純。

HWS-24雙列四孔恒溫水浴鍋 上?；厶﹥x器制造有限公司；JA1003B光電分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140A烘箱 上?；厶﹥x器制造有限公司；TGL-20C冷凍離心機(jī) 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；UV1102PC紫外可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器；DHG-9140A數(shù)顯電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上?；厶﹥x器制造有限公司；BPH-9082精密恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊棲菜樣品制備[8]干羊棲菜預(yù)處理→消化→勻漿→羊棲菜全藻組分（每毫升全藻組分含0.1g干羊棲菜，即0.1g/mL）

干羊棲菜預(yù)處理→熱水浸提→冷卻→過(guò)濾→離心→濃縮→羊棲菜水提液（每毫升水提液含1g干羊棲菜，即1g/mL）

工藝說(shuō)明：a.羊棲菜預(yù)處理：自來(lái)水浸泡過(guò)夜，洗凈，切小段。b.消化：加入5‰ Na2CO3即純堿，90℃、消化6h。c.勻漿：組織勻漿機(jī)勻漿得全藻組分。d.熱水浸提、離心：熱水浸提兩次，100℃水浴2h，400目濾網(wǎng)過(guò)濾，合并濾液，離心得上清，濃縮后即為羊棲菜水提液。

1.2.2 羊棲菜樣品中相關(guān)成分檢測(cè)方法

1.2.2.1 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖濃度[9]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（40μg/mL），分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，各以水補(bǔ)至2.0mL，然后加入6%苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，靜置10min后搖勻，室溫放置20min后于490nm測(cè)定吸光度。以2.0mL水按同樣方法操作，作為空白，以多糖微克數(shù)為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.0089x，R2=0.996。

樣品多糖含量測(cè)定：吸取樣品液1.0mL，按上述步驟操作，測(cè)光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算羊棲菜水提液、全藻組分中多糖含量。

1.2.2.2 硫酸基的氯化鋇-比濁法測(cè)定硫酸根含量[10]

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精確吸取0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mL標(biāo)準(zhǔn)硫酸基溶液于具塞試管中，標(biāo)記為0、1、2、3、4、5、6管，各管以lmol/L HCI溶液補(bǔ)加總體積至0.2mL。另加入3.8mL 3%三氯乙酸和lmL氯化鋇-明膠溶液，混合，室溫靜置15min，于分光光度計(jì)上測(cè)定360nm處測(cè)光密度值，以0管作對(duì)照得A1。另用同樣標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，唯以明膠試液代替氯化鋇一明膠溶液，于分光光度計(jì)上測(cè)定360nm處測(cè)光密度值，以0管作對(duì)照得A2。以硫酸基微克數(shù)為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為吸光度（A1-A2），作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.0008x，R2=0.995。

樣品含量測(cè)定：以lmol/L HCl作溶劑配制適量濃度的樣品液，封閉管在100℃加熱3h，冷卻后吸取0.2mL進(jìn)行分析，按上法測(cè)光密度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算硫酸基含量。

1.2.2.3 總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定 根據(jù)GB/T 5009.11-2003《食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》。

1.2.3 羊棲菜樣品對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn) 參照經(jīng)典的急性毒性實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行羊棲菜全組分、水提液的急性毒性實(shí)驗(yàn)[11-13]。

1.2.3.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)之前，首先做預(yù)實(shí)驗(yàn)以便為正式實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。若死亡率≥30%，則測(cè)定半數(shù)致死量（LD50）；如不足以引起死亡，則采用最大灌胃量測(cè)定。小鼠12只，隨機(jī)分為3組（全組分組、水提組、對(duì)照組），雌雄各半，灌胃前禁食不禁水12h。給藥組給以可供灌胃的最大濃度（全組分0.1g/mL、水提液1g/mL）、小鼠灌胃可承受的最大體積（0.8mL/20g）一次灌胃給藥，給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7d。對(duì)照組給予等量蒸餾水。結(jié)果小鼠全部存活，灌胃給藥無(wú)法測(cè)出本品的半數(shù)致死量（LD50），提示該藥是較安全的。

1.2.3.2 正式實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行小鼠最大給藥量的實(shí)驗(yàn)。昆明種鼠60只，隨機(jī)分為三大組：全組分組、水提組、對(duì)照組，每組20只，雌雄各半。日內(nèi)3次灌胃，以最大給藥濃度、最大灌胃體積進(jìn)行灌胃，連續(xù)觀察7d，詳細(xì)記錄小鼠的體重、活動(dòng)、飲食、毛發(fā)、大小便及死亡情況。計(jì)算出總給藥量，并推算出相當(dāng)于臨床用藥量的倍數(shù)，以耐受成人用量口服100倍以上為安全。計(jì)算方法：

小鼠最大給藥量（g/kg，系折合生藥量計(jì)算）=每日小鼠灌胃量（mL/kg）×藥物濃度（g/mL）×每克樣品的生藥量（g/g）；

小鼠最大耐受量倍數(shù)=每只小鼠的耐受量（g/kg）/小鼠平均體重（kg）×成人平均體重（g/kg）/成人每天用量（kg）；

小鼠總砷最大給藥量（μg/kg）=小鼠最大灌胃量（mL/kg）×樣品總砷含量（μg/mL）；

小鼠無(wú)機(jī)砷最大給藥量（μg/kg）=小鼠最大灌胃量（mL/kg）×樣品無(wú)機(jī)砷含量（μg/mL）。

表1 羊棲菜樣品中多糖、硫酸根、總砷及無(wú)機(jī)砷含量（）Table 1 The contentof polysaccharides，sulfuric radical，total arsenic and inorganic arsenic in Sargassum fusiforme samples（）

樣品 多糖（mg/mL） 硫酸根（mg/mL） 總砷含量（μg/mL） 無(wú)機(jī)砷含量（μg/mL）全組分（0.1g生藥量/mL） 11.5 0.534 1.2 1.0水提組分（1g生藥量/mL） 14.5 2.9 4.4 3.6

1.2.4 羊棲菜樣品的抑菌性實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 細(xì)菌的培養(yǎng)及菌液制備 將-80℃保存的金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌、大腸桿菌復(fù)蘇后分別接種于TSA固體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、BHI固體培養(yǎng)基，一定條件下37℃培養(yǎng)24h，涂片鏡檢后挑單菌落分別接種于TSB液體培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基，一定條件下37℃培養(yǎng)24h，收集菌液，調(diào)節(jié)菌濃度為1.8×l04CFU/m L。

1.2.4.2 樣品對(duì)三種細(xì)菌最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定[14]采用液體稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），具體方法為：在96孔板中羊棲菜全藻組分從25mg/m L濃度開始進(jìn)行二倍稀釋，序列中水提液最低濃度為0.2mg/m L；羊棲菜水提液從250mg/m L濃度開始進(jìn)行二倍稀釋，序列中水提液最低濃度為2.0mg/m L。每孔樣品液和菌液各100μL，37℃培養(yǎng)48h，肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的樣品液最低濃度為MIC。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照組為樣品液和液體培養(yǎng)基各100μL，其樣品藥物濃度對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組樣品藥物濃度；陽(yáng)性對(duì)照組為相應(yīng)液體培養(yǎng)基和菌液各100μL。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔。取肉眼觀察清亮的實(shí)驗(yàn)組孔中的液體，劃線接種于相應(yīng)固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)48h，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最低殺菌濃度（minimal bactericidalconcentration，MBC）。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 統(tǒng)計(jì)分析：所有的數(shù)據(jù)用均數(shù)或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用Independent Samples t Test，統(tǒng)計(jì)軟件用SPSS 18.0，p＜0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01表示差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊棲菜樣品中多糖、硫酸根、總砷及無(wú)機(jī)砷含量

干羊棲菜全藻的基本成分為：蛋白質(zhì)12.05%、碳水化合物60.71%、脂肪0.45%、灰分12.47%、水分含量14.32%[15]。羊棲菜水提物的成分比較復(fù)雜，但現(xiàn)已基本確定其有效成分主要是羊棲菜多糖。由表1可知，全組分中多糖得率為11.5%，硫酸根占多糖含量的4.6%。水提物多糖得率為1.45%，硫酸根占多糖含量的20%。羊棲菜全組分及水提物中無(wú)機(jī)砷含量都超過(guò)了GB 19643-2005《藻類制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于藻類中無(wú)機(jī)砷（干重計(jì)）≦1.5mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)（這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)砷的毒性和人體藻類可能攝入量來(lái)定的），且無(wú)機(jī)砷含量均占總砷含量的80%以上。顧晶晶等[16]報(bào)道LD50與無(wú)機(jī)砷呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即無(wú)機(jī)砷含量越高毒性越大，相比較與總砷含量的相關(guān)性較差。

2.2 羊棲菜水提液、全組分對(duì)小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 一般情況 由表2可以看出，小鼠按最大容量于1d內(nèi)灌胃給予最大限度的樣品后，連續(xù)觀察7d，所有受試小鼠毛色光潔，飲食、活動(dòng)和二便正常，鼻、眼、口腔無(wú)異常分泌物，未出現(xiàn)不良情況和死亡情況。

2.2.2 體重變化 由表3可以看出，給藥組與對(duì)照組小鼠體重在給藥后7d均增加，但給藥組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

表3 羊棲菜樣品最大給藥量實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠體重的影響（±SD）Table 3 The change ofmice body weightunder the maximum dose of the Sargassum fusiforme samples（±SD）

注：給藥組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

組別 給藥前體重（g）給藥后體重（g）體重前后變化（g）全組分組 19.24±1.14 21.54±1.30 2.3±0.62水提組 19.11±1.16 21.75±1.37 2.64±0.73對(duì)照組 18.51±0.84 20.63±1.08 2.12±0.38

2.2.3 臟器觀察 對(duì)三組小鼠進(jìn)行大體解剖，觀察心、肝、脾、肺、腎、胃腸等主要臟器，均未見組織有異常改變。

2.2.4 結(jié)果計(jì)算 羊棲菜全組分組小鼠最大給藥量為12g生藥量/kg·BW，表明小鼠對(duì)羊棲菜全藻組分組的耐受量至少為12g生藥量/kg·BW，相當(dāng)于成人擬定日食用干羊棲菜量（5g/d）的120倍；折算成小鼠總砷最大給藥量144μg/kg，相當(dāng)于成人每日總砷允許攝入量（WHO：暫定總砷攝入的安全標(biāo)準(zhǔn)為每日50μg/kg·BW）的2.9倍；折算成小鼠無(wú)機(jī)砷最大給藥量120μg/kg，相當(dāng)于成人每日無(wú)機(jī)砷允許攝入量（WHO：暫定無(wú)機(jī)砷攝入的安全標(biāo)準(zhǔn)為每日2.1ug/kg BW）的57.1倍。

羊棲菜水提組小鼠最大給藥量為120g生藥量/kg BW，表明小鼠對(duì)羊棲菜水提液的耐受量至少為120g生藥量/kg·BW，相當(dāng)于50kg成人擬定日食用干羊棲菜量的1200倍；折算成小鼠總砷最大給藥量528μg/kg，相當(dāng)于成人每日總砷允許攝入量的10.6倍；折算成小鼠無(wú)機(jī)砷最大給藥量432μg/kg，相當(dāng)于成人每日無(wú)機(jī)砷允許攝入量的206倍。

2.3 羊棲菜樣品對(duì)三種細(xì)菌最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，羊棲菜全組分對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為125mg/m L，MBC為250mg/m L；羊棲菜水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC、MBC均為125mg/m L。羊棲菜全組分及水提液對(duì)大腸桿菌、變異鏈球菌均未觀察到抑菌作用。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)首先證實(shí)了羊棲菜全藻樣品及水提樣品中無(wú)機(jī)砷含量超標(biāo)，但在隨后進(jìn)行的羊棲菜全藻樣品及水提樣品對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)中，并沒有觀察到有相應(yīng)的砷中毒現(xiàn)象發(fā)生，理論上可初步判定羊棲菜全藻樣品及水提樣品毒性較低，可食用性較好。這種現(xiàn)象，一方面原因可能是羊棲菜樣品中豐富的多糖除具有吸收脂肪和膽固醇的作用外，對(duì)重金屬和放射性元素亦具有阻吸作用[17]，或者是羊棲菜本身含有的某些其他成分在體內(nèi)對(duì)砷的毒性有抵抗作用，這就有待于后期的進(jìn)一步探索。另一方面，關(guān)于毒性的概念，不能停留在急性毒性的認(rèn)識(shí)上，毒性與劑量、接觸途徑、接觸期限等都有密切關(guān)系，所以評(píng)價(jià)毒性，不能僅以急性毒性高低來(lái)表示，針對(duì)有一些有害物質(zhì)的急性毒性是屬于低毒或微毒，但卻有蓄積毒性、亞急性、亞慢性毒性、致畸毒性、生殖毒性、致癌性等其他毒性，而這些毒性對(duì)人類的健康造成的傷害是巨大的。故關(guān)于羊棲菜的食用安全性研究，還應(yīng)該結(jié)合長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)的毒性表現(xiàn)及多種檢測(cè)結(jié)果綜合分析評(píng)價(jià)其毒性。

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