采后鈣處理對(duì)雙孢菇貯藏生理的影響

孫 婭，李志強(qiáng)，＋，王毓寧，張維敏，李鵬霞，*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇南京 210014；2.國(guó)家農(nóng)業(yè)科技華東（江蘇）創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014；3.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇南京210037）

雙孢菇（Agaricus bisporus）屬于傘菌目、傘菌科、蘑菇屬，因營(yíng)養(yǎng)豐富和味道鮮美而備受青睞。采收后的雙孢菇由于組織柔嫩，含水量多[1]且菌蓋無(wú)明顯保護(hù)結(jié)構(gòu)，采后易發(fā)生褐變、開傘等變化，嚴(yán)重影響其品質(zhì)和貨架期壽命[2-3]，常溫下僅能保存3～4d[4]。隨著種植面積的擴(kuò)大和生產(chǎn)數(shù)量的增加，雙孢菇的貯藏問(wèn)題就顯得尤為突出。因此，研究雙孢菇采后貯藏保鮮技術(shù)，對(duì)延長(zhǎng)其運(yùn)輸時(shí)間和貨架期限，提高其采后經(jīng)濟(jì)效益具有重大的意義。采后鈣處理已廣泛地應(yīng)用于果蔬保鮮中，主要包括蘋果[5]、梨[6]、番茄[7]等；同時(shí)鈣處理簡(jiǎn)單易行、成本低廉，而Ca2+綠色環(huán)保，無(wú)毒副作用，因此在生產(chǎn)上具有廣泛的應(yīng)用前景。適當(dāng)濃度的鈣能夠維持細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定[5，8-9]；降低果實(shí)呼吸強(qiáng)度、推遲后熟，減緩果實(shí)軟化進(jìn)程[10]；并能夠提高過(guò)氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等與果蔬抗氧化相關(guān)的酶活性[11]，清除自由基減緩衰老。鈣處理在食用菌保鮮方面的研究鮮見報(bào)道，主要集中在香菇[12]、金針菇[13]上，對(duì)雙孢菇的研究目前尚未見報(bào)道。本文作者前期研究了不同濃度（0.5%、1.0%和2.0%）的氯化鈣處理對(duì)采后雙孢菇貯藏期間品質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5%CaCl2處理可以有效的抑制呼吸強(qiáng)度、推遲呼吸峰的到來(lái)，并能減緩總糖、蛋白質(zhì)、維生素C、原果膠含量的下降程度，抑制游離氨基酸和可溶性果膠含量的上升，處理效果最好，而高濃度的CaCl2（1.0%和2.0%）對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用，不利于貯藏保鮮。本文在前期工作的基礎(chǔ)上，研究了不同濃度氯化鈣對(duì)雙孢菇采后生理的影響，進(jìn)一步闡述了氯化鈣對(duì)雙孢菇的保鮮作用機(jī)制，為雙孢菇貯藏保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙孢菇（Agaricus bisporus）由江蘇宿遷雙孢菇種植基地提供，采收后分層放置于包裝筐內(nèi)，以防擠壓和機(jī)械傷害，并于2h內(nèi)迅速運(yùn)至江蘇省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工所以供實(shí)驗(yàn)，選擇顏色潔白、大小均勻、成熟度一致，無(wú)病蟲害和機(jī)械損傷的健壯菇作為實(shí)驗(yàn)材料。

UV1102紫外/可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；TGL-18M上海盧湘儀離心機(jī) 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；GZX-250BS-Ⅲ光照培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理實(shí)驗(yàn) 設(shè)三個(gè)濃度處理：a.0.5%CaCl2（W/V）；b.1.0%CaCl2；c.2.0%CaCl2，清水處理做對(duì)照（CK），每個(gè)處理設(shè)定三個(gè)重復(fù)；實(shí)驗(yàn)材料去根后，在30min內(nèi)開始處理，浸泡處理1min，小心撈出瀝干，聚乙烯塑料薄膜包裝以防失水，并貯藏于（溫度0～2℃、相對(duì)濕度90%～95%）冷庫(kù)中，每2d取樣觀察并測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)，共計(jì)14d，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次測(cè)定。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1 超氧陰離子自由基（O2-）產(chǎn)生速率測(cè)定 參照陳建勛和王曉峰[14]的方法。稱取樣品5g，加入10mL 65mmol/L pH7.8的磷酸緩沖液（PBS）研磨過(guò)濾，5000r/min離心10min。取上清液1mL，加入65mmol/L PBS 0.9mL，10mmol/L羥胺氯化物0.1mL（以PBS作空白）混合后，于25℃恒溫水浴中培養(yǎng)20min。取上述培養(yǎng)液0.5mL，分別加入17mmol/L對(duì)氨基苯磺酸0.5mL，7mmol/L ɑ-萘胺0.5mL，25℃恒溫水浴保溫反應(yīng)20min。加入1.5mL的正丁醇搖勻后，取正丁醇相測(cè)定530nm處的吸光值并根據(jù)NO2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出O2-的產(chǎn)生速率，單位用nmol/（min·g）表示。其中每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)定。計(jì)算公式：超氧陰離子自由基（O2-）產(chǎn)生速率=（n×V×1000）/（Vs×t×m×蛋白含量）。式中：n：標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的超氧陰離子物質(zhì)的量（μmol）；V：樣品提取液總體積（mL）；Vs：吸取樣品液體積（mL）；t：樣品與羥胺反應(yīng)時(shí)間（min）；m：樣品質(zhì)量（g）。

1.2.2.2 脂氧合酶（LOX）活性測(cè)定 參照Axelrod等[15]的方法并加以改進(jìn)。取5g樣品置于研缽內(nèi)，加入10mL 50mmol·L-1PBS（pH7.0）冰浴研磨至勻漿，4℃15000r/min離心15min，上清液用于LOX活性的測(cè)定。3mL反應(yīng)體系中包括亞油酸鈉（100mmol·L-1）25μL，醋酸緩沖液（100mmol·L-1，pH6.0）2.775mL，酶液0.2mL，30℃下反應(yīng)并于234nm處記錄1min內(nèi)的吸光值變化，單位用U/（g protein）表示。其中每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)定。

1.2.2.3 過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚法[16]。樣品（5g）加入10mL預(yù)冷的0.05mg·L-1PBS（pH7.0），冰浴研磨，4℃下12000r/min離心20min，所得上清液即為粗酶液；取上述酶液30μL，加入到內(nèi)含20μL 40mmol·L-1H2O2、2.9mL 50mmol·L-1PBS（pH7.0）、50μL 20mmol·L-1愈創(chuàng)木酚的混合液中反應(yīng)，對(duì)照用30μL 50mmol·L-1PBS（pH7.0）代替酶提取液。測(cè)定反應(yīng)液在470nm處的吸光值，以O(shè)D470每分鐘變化0.01光密度值作為一個(gè)酶活力單位，單位用U/（g protein）表示。其中每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)定。

1.2.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定 采用氮藍(lán)四唑（NBT）法[17]并加以改進(jìn)。稱取5g樣品，加入10mL 62.5mmol·L-1PBS（pH7.8）冰浴研磨，于13000r/min 4℃離心20min，所得上清液即為酶液。在試管中分別加入3mL反應(yīng)液（54mL 14.5mmol/L dl-甲硫氨酸中分別加入3μmol/L EDTA、2.25mmol/L NBT、60μmol/L核黃素溶液各2mL）和酶液0.02mL，混合后在光照培養(yǎng)箱內(nèi)照光（8000lx）10min后立即避光，迅速測(cè)定560nm下的吸光值，以單位時(shí)間內(nèi)抑制光化還原50%的NBT為一個(gè)酶活力單位，單位用U/（g protein）表示。其中每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)定。

1.2.2.5 過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定 參照曹建康的方法[18]。稱取樣品5g置于研缽中，加入10mL 4℃下預(yù)冷的PBS（pH7.0）研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)移并定容至25mL容量瓶?；旌暇鶆蚝?℃下靜置10min，取上清液4000r/min離心15min，所得上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液。反應(yīng)液包括0.2mL酶液、1.5mL PBS、1mL H2O2，25℃預(yù)熱后，逐管加入0.3mL 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測(cè)定其吸光值，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，以1min內(nèi)OD240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位，單位用U/（g protein）表示。其中每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)定。

1.2.2.6 多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定 參照湯章城[19]的方法。樣品（5g）加入10mL預(yù)冷的0.05mg·L-1PBS（pH6.5），冰浴研磨，4℃下12000r/min離心20min，所得上清液即為酶液；在試管中依次加入1mL 0.1mmol/L鄰苯二酚、3.9mL 50mmol/L PBS（pH6.5）、酶液0.1mL，對(duì)照用0.1mL 50mmol/L PBS（pH6.5）代替酶液。在30℃下反應(yīng)2min，測(cè)定反應(yīng)液在525nm處的吸光值，以O(shè)D525每分鐘變化0.01光密度值作為一個(gè)酶活力單位，單位用U/（g protein）表示。其中每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)定。

1.2.2.7 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[20]。稱取樣品5g放入研缽中，加10mL蒸餾水研磨成勻漿并轉(zhuǎn)移到離心管中，用6mL蒸餾水分次洗滌研缽，4000r/min離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移并定容至10mL，搖勻待測(cè)。以牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定595nm下的吸光值，單位用mg/g表示。其中每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行Duncan多重差異比較及相關(guān)性分析，當(dāng)p＜0.05時(shí)，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣處理對(duì)雙孢菇超氧陰離子自由基（O2-）產(chǎn)生速率的影響

2.2 鈣處理對(duì)雙孢菇脂氧合酶（LOX）活性的影響

鈣處理對(duì)雙孢菇LOX活性有明顯的影響，且隨著貯藏時(shí)間的增加，LOX活性呈下降趨勢(shì)（見圖2）。其中，0.5%CaCl2處理下雙孢菇LOX活性下降幅度最大，且在整個(gè)貯藏期間均低于對(duì)照，14d時(shí)為對(duì)照的89.27%；1.0%和2.0%的CaCl2處理與對(duì)照相比，不能有效地抑制LOX活性，14d時(shí)分別高于對(duì)照15.74%和36.66%。由此可以看出，0.5%CaCl2處理對(duì)雙孢菇貯藏期間LOX活性有很好的抑制作用，能夠減緩雙孢菇的衰老。0.5%與2.0%CaCl2處理之間有顯著差異（p＜0.05），而與對(duì)照和1.0%CaCl2處理之間差異不顯著（p＞0.05）。

2.3 鈣處理對(duì)雙孢菇過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響

如圖3所示，與0d相比，不同處理下雙孢菇POD活性呈現(xiàn)整體下降的趨勢(shì)。其中0.5%CaCl2處理在第4d時(shí)POD活性為對(duì)照的1.68倍，比對(duì)照出現(xiàn)第一次最大值時(shí)提前了2d，隨后下降又上升至第10d達(dá)到對(duì)照的1.97倍，14d時(shí)為對(duì)照的144.87%；1.0%CaCl2處理在第6d達(dá)到對(duì)照的1.09倍，隨后下降，14d時(shí)達(dá)到對(duì)照的115.23%；2.0%CaCl2處理在第6d時(shí)POD活性低于對(duì)照0.71%，在10d達(dá)到對(duì)照的1.35倍，14d時(shí)為對(duì)照的87.13%。以上可知，0.5%和1.0%CaCl2處理能夠迅速地提高POD活性，從而消除過(guò)氧化物，降低活性氧的傷害，進(jìn)而維持雙孢菇的貯藏品質(zhì)，其中0.5%CaCl2處理效果最好。0.5%與1.0%CaCl2處理之間無(wú)顯著差異（p＞0.05），而與對(duì)照和2.0%CaCl2處理之間差異顯著（p＜0.05）。

2.4 鈣處理對(duì)雙孢菇超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖4可以看出，不同處理下雙孢菇的SOD活性在貯藏過(guò)程中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。其中0.5%CaCl2處理在整個(gè)貯藏期間SOD活性均高于對(duì)照，14d時(shí)為對(duì)照的106.45%；1.0%CaCl2處理在第14d達(dá)到對(duì)照的97.72%，僅在12d處高于對(duì)照3.83%，其余時(shí)間SOD活性低于對(duì)照；2.0%CaCl2處理在整個(gè)貯藏期間均低于對(duì)照，14d時(shí)為對(duì)照的90.41%。由此可以看出，0.5%CaCl2處理更有利于保持雙孢菇較高的SOD活性，減少活性氧對(duì)其的傷害，延緩雙孢菇衰老。其中各處理之間無(wú)顯著差異（p＞0.05）。

2.5 鈣處理對(duì)雙孢菇過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理下雙孢菇的CAT活性呈現(xiàn)總體上升趨勢(shì)（見圖5）。0.5%CaCl2處理在整個(gè)貯藏期間CAT活性均高于對(duì)照，且在4d時(shí)高于對(duì)照2.90%，在第14d時(shí)為對(duì)照的102.19%；1.0%CaCl2處理在第6d時(shí)CAT活性高于對(duì)照2.25%，比對(duì)照出現(xiàn)第一次最大值時(shí)推遲了2d，其余時(shí)間均低于對(duì)照，14d時(shí)為對(duì)照的97.81%；2.0%CaCl2處理下CAT活性在整個(gè)貯藏期間均低于對(duì)照，且在第14d時(shí)為對(duì)照的87.98%，各處理在整個(gè)貯藏期間和對(duì)照相比差異不顯著（p＞0.05）。由以上分析可知，0.5%CaCl2處理在貯藏期間增長(zhǎng)幅度最大，且在貯藏期間均高于對(duì)照，說(shuō)明0.5%CaCl2處理能使CAT活性維持在較高水平，進(jìn)而清除H2O2的積累，有利于維持雙孢菇細(xì)胞內(nèi)自由基代謝的穩(wěn)定性。

2.6 鈣處理對(duì)雙孢菇多酚氧化酶（PPO）活性的影響

從圖6可以看出，雙孢菇在貯藏期間PPO活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。0.5%CaCl2處理下降幅度最大，且在14d內(nèi)均低于對(duì)照；1.0%CaCl2處理也能夠在一定程度上降低PPO的活性，但在第4d和第8d均高于對(duì)照5.76%和52.34%，第14d時(shí)為對(duì)照的85.52%；2.0%CaCl2處理不能有效減少PPO的活性，在第14d高于對(duì)照9.83%。以上分析表明，0.5%和1.0%CaCl2處理均能降低雙孢菇中PPO的活性，但0.5%CaCl2處理效果更好。其中對(duì)照與0.5%CaCl2處理之間有顯著差異（p＜0.05），而與1.0%和2.0%CaCl2處理之間差異不顯著（p＞0.05）。

3 討論

3.1 鈣處理對(duì)雙孢菇O2-產(chǎn)生速率的影響

超氧陰離子（O2-）可直接作用于蛋白而進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為對(duì)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)有破壞作用的活性氧，因此O2-的生成速率可以反映出植物細(xì)胞受損情況。徐炯達(dá)等研究[21]發(fā)現(xiàn)，熱處理和鈣處理均能明顯地降低蘋果梨果實(shí)貯藏期間O2-的生成速率。從實(shí)驗(yàn)中可以看出，0.5%的氯化鈣處理能夠有效地抑制雙孢菇中O2-的產(chǎn)生速率，維持活性氧代謝，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而延緩雙孢菇的衰老。

3.2 鈣處理對(duì)雙孢菇LOX酶活性的影響

脂氧合酶（LOX）在果實(shí)成熟和衰老過(guò)程中起著十分重要的作用。它以亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸為底物，啟動(dòng)膜脂過(guò)氧化，產(chǎn)生過(guò)氧自由基，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終引起細(xì)胞的衰老和死亡。史蘭等[22]發(fā)現(xiàn)0.5%CaCl2處理降低了冬棗LOX活性，延緩了冬棗的衰老過(guò)程。本研究中發(fā)現(xiàn)低濃度的鈣處理（0.5%）對(duì)雙孢菇LOX活性有很好的抑制作用，能夠延緩雙孢菇的衰老。

3.3 鈣處理對(duì)雙孢菇抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性的影響

過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）是一類普遍存在于植物中的抗氧化酶，其活性與植物的代謝及抗衰老能力有密切關(guān)系。其中POD能夠催化植物組織中低濃度的H2O2氧化其他底物，從而清除H2O2，降低其對(duì)植物組織的毒害；SOD屬于一類含不同金屬離子的氧化還原酶，它能夠清除組織代謝產(chǎn)生的活性氧，防止O2-的毒害作用，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性；CAT可以分解植物體內(nèi)高濃度的H2O2，清除活性氧的傷害。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鈣處理可以通過(guò)提高POD、SOD、CAT的活性，防止活性氧的積累，進(jìn)而延緩雙孢菇的衰老，延長(zhǎng)運(yùn)輸和貨架期限，這與王煒等[5]研究結(jié)論一致。綜合分析表明，0.5%CaCl2處理與其他濃度相比效果最好，能夠快速地提高雙孢菇POD、SOD、CAT的活性，維持細(xì)胞內(nèi)自由基代謝的穩(wěn)定性，其中1.0%CaCl2處理能夠提高雙孢菇POD的活性，維持雙孢菇的品質(zhì)。

3.4 鈣處理對(duì)雙孢菇褐變過(guò)程中關(guān)鍵酶（PPO）活性的影響

雙孢菇的褐變主要由酶促反應(yīng)引起，在有O2條件下，多酚氧化酶（PPO）能將無(wú)色酚類化合物氧化成紅褐色的醌，醌再進(jìn)一步與氨基酸反應(yīng)生成“類黑色聚合物”，從而導(dǎo)致雙孢菇褐變，影響其品質(zhì)。有研究表明，3%鈣處理能夠降低冷藏期間桃PPO的活性[23]，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.5%和1.0%CaCl2處理均能降低雙孢菇貯藏期間PPO的活性，抑制貯藏過(guò)程中雙孢菇的褐變，但0.5%CaCl2處理效果更好。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，0.5%濃度的氯化鈣處理能夠有效的抑制O2-和LOX的產(chǎn)生、提高POD、SOD、CAT的活性，減少植物組織中PPO的產(chǎn)生，這可能是由于適當(dāng)濃度的鈣能夠維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，進(jìn)而保持防御系統(tǒng)中酶的活性；同時(shí)使細(xì)胞清除活性氧自由基的能力增強(qiáng)，減少自由基對(duì)膜系統(tǒng)的損傷，延緩雙孢菇的衰老過(guò)程[24]。1.0%CaCl2處理能提高POD的活性和降低PPO的活性，但對(duì)其他生理指標(biāo)效果不明顯；2.0%CaCl2處理效果不好，不能延緩雙孢菇的衰老。由此可以看出，高濃度的CaCl2對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用，會(huì)造成雙孢菇生理混亂，導(dǎo)致貯藏保鮮效果不理想。同時(shí)，據(jù)本文作者的前期研究結(jié)果表明0.5%CaCl2處理可以有效的抑制呼吸強(qiáng)度、推遲呼吸峰的到來(lái)，并能減緩總糖、蛋白質(zhì)、維生素C、原果膠含量的下降程度，抑制游離氨基酸和可溶性果膠含量的上升；1%CaCl2處理能夠推遲呼吸峰的產(chǎn)生時(shí)間，在貯藏后期（12～14d）抑制蛋白質(zhì)含量的下降且0～4d時(shí)VC含量也高于對(duì)照；2%CaCl2處理下0～8d內(nèi)總糖含量較高，12～14d時(shí)蛋白質(zhì)含量高于對(duì)照。兩者的研究結(jié)果較為一致。綜合考慮，0.5%CaCl2處理可用于雙孢菇的貯藏保鮮并在生產(chǎn)中具有推廣價(jià)值。

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